生態環境狀況越來越受到人們的關注,越來越多的化學合成物在改善人們生活的同時也帶來對環境的危害,進而影響我們的健康。對於環境中存在的這些有害物質,必需有效、及時地進行監測。
對環境汙染物的傳統檢測方法包括基於化學、物理學和生物學原理的多種方法。化學檢測法如氣相色譜、液相色譜、氣質聯用、液質聯用等方法,可以對測定目標物進行定性定量測定,並鑑定其化學結構,但大部分化學方法需要專業技術,消耗時間和經費較多,一般一次只能測定一種目標物,且不能反應汙染物毒性的大小;物理檢測法如雷射、雷達等,適合對大氣和大面積水面汙染進行遙測,但目前的方法設備較重、價格昂貴、結果分析複雜;生物檢測法如水蚤、魚、植物根系細胞、動物細胞、細菌等,測定的是環境汙染物的毒性效應或多種汙染物的綜合、協同毒性,在汙染物毒性篩查,特別是液體檢測樣品毒性檢測方面,具有敏感、快速、耗資少等特點,但不能直接鑑定汙染物化學結構。在已知汙染物檢測方面,化學方法準確可靠;在未知毒物監測、特別是水質在線監測方面,生物檢測具有天然優勢。針對傳統生物毒性檢測方法的不足,發光細菌法作為一種新型生物毒性監測技術正在廣泛應用,引起了廣大環保科研工作者的關注。
發光細菌為何物?
夏天的夜晚螢火蟲一明一暗的發光是人們很早就認識的自然生物現象。這類非常奇特的能夠發光的生物,除了螢火蟲之外,在自然界中還有不少,甲殼類、放射蟲類、直至細菌,也有能發出可見光的種類,而且已知的有十餘種,我們把這些天然存在,在正常生理條件下能夠發射可見螢光的細菌,統稱為「發光細菌」。
大多數發光菌為直的桿菌,兩端鈍圓,也有彎曲呈弧狀的,也有的桿菌較短,呈球桿狀。它們一般單個存在,不聚集在一起。由於有鞭毛,所以它們可以自由地遊動。有的發光細菌僅有一根鞭毛,很象蝌蚪;有的一端有數根鞭毛,少數種類有周生鞭毛。不同種屬的發光細菌大小略有差異,且處於不同生長期的細胞大小也有不同。一般菌體長約1.5~4μm,寬約0.5~0.8μm。由於發光細菌形體微小,肉眼根本看不見它們,因此單個細菌所發出的光也極微弱,肉眼當然也看不見的。但是,當發光細菌成千上萬地生長聚集在一起,如果聚成一小點或一小片,則就可以在黑暗的環境中看到這一小點或一小片綠熒熒的光。如果發光菌在某個物體表面長成一片,則在黑暗可以看到一片熒熒綠光。如果發光細菌在某種水體裡生長繁殖,經過一段時期,局部水體裡的發光細菌達到一定的數量時,就會使這個水體發出綠熒熒的螢光,在黑暗的環境中清晰可辨,其亮度有時甚至可以照亮周圍的物體。海洋中就會有這種現象發生,海水整個都變成綠色的發光體,閃現著綠熒熒的波浪,這就是所謂的「海火」。當然,畢竟發光細菌所發光的亮度是很低的,因此只有在黑暗的環境中才能看到它們的發光,在白天光線較亮的地方是看不到它們發光的。
海洋是發光細菌的主要棲息地,絕大部分的發光細菌無論從數量或種類來看,都是海洋性的,僅有少數是淡水型或陸地生存的。目前已經命名的發光細菌共有18種。其中霍亂弧菌(Vibriochole rea)和我國學者在青海湖唯一的一種無鱗魚——裸鯉體表分離得到的青海弧菌(V.qi n g haiensis)為淡水發光細菌,光桿菌屬(Photorhabd us)為陸生發光細菌,其餘皆為海洋發光細菌。海洋發光細菌的最主要特徵就是需要高滲透壓、高鹽度的環境以及對Na離子的依賴:必需有一定濃度的Na離子存在的外界條件下才能生長和發光,否則就不能生長更不會正常發光。而淡水型或陸生型的發光細菌則不論有無Na離子,均能正常生長和發光。因此,對高鹽度(約3%)和Na離子的需要是海洋發光菌與非海洋發光菌的基本區分。
在自然狀態中,發光細菌有的是自由生存的,也有附著於海洋生物如魚、蝦、烏賊、魷魚等身體上生存的,更有生存在海洋生物的消化道內的,這幾種情形中發光菌是營腐生或寄生生活。還有不少發光菌是與其他海洋動物共生的。而且這些動物往往形成專門的發光器官,其功能就是進行發光照明。我們知道,發光菌與其共生的宿主往往是彼此互相適應的,專一的。也就是說,在某種動物體內共生的發光菌也只能是某一個種的發光菌,其他種的發光菌是分離不到的。發光菌與其共生宿主的關係應該是互利共生:發光菌因宿主提供營養而在其中生存,而宿主則可以利用發光取食或避敵。但不少種類的發光菌是致病菌,例如哈維氏弧菌可致養殖的蝦生病死亡,發光光桿菌則寄生於線蟲體內,這些線蟲可感染鱗翅目昆蟲並致昆蟲死亡,有時這些昆蟲屍體還會發光。
細菌為什麼會發光?
發光是發光細菌的一種生理過程,是由分子氧作用、胞內細菌螢光酶催化,將還原態的黃素單核苷酸(FMNH2:reduced flavin mononucleotide)及長鏈脂肪醛(如十二烷醛)氧化為黃素單核苷酸(FMN:oxidized flavin mononucleotide)及長鏈脂肪酸,同時釋放出波長為450~490 nm處的藍綠光。這種發光過程極易受到外界條件的影響,凡是幹擾或損害細菌呼吸或生理過程的任何因素都能使細菌的發光強度發生變化。當有毒有害物質與發光細菌接觸時,發光強度改變,並隨著毒性物質濃度的增加發光減弱,且發光強度減弱的程度與毒性物質的含量呈一定的相關性。因此,可利用發光細菌作為指示微生物,以發光強度的變化為指標,測定環境中有毒有害物質的生物毒性,從而對環境中的汙染物質進行監測和汙染風險評價。
發光細菌法的應用原理
發光細菌法是利用靈敏的光電測量系統測定毒物對發光細菌發光強度的影響。發光細菌含有螢光素、螢光酶、ATP等發光要素,在有氧條件下通過細胞內生化反應而產生微弱螢光。當細胞活性升高,處於積極分裂狀態時,其ATP含量高,發光強度增強。發光細菌在毒物作用下,細胞活性下降,ATP含量水平下降,導致發光細菌發光強度的降低。實驗顯示,毒物濃度與菌體發光強度呈線性負相關關係,因而,可以根據發光細菌發光強度判斷毒物毒性大小,用發光度表徵毒物所在環境的急性毒性。