1.如何測定引物的OD值？
用紫外分光光度計在260nm波長測定溶液的吸光度來定量，請注意紫外分光光度計的使用，測定時溶液的吸光度最好稀釋到0.2-0.8之間(吸光度太高或太低會有較大的誤差)。DNA乾粉用一定體積的水充分振蕩溶解以後，取部分溶液稀釋到1ml並在1ml標準比色皿中測定其吸光度，即為所測體積的OD值，進而可以計算出母液的OD值。
舉例：您拿到一管幹粉的DNA，用1ml水溶解成母液，取該母液50μL稀釋成1ml並在1ml標準比色杯中測定的吸光度為0.25，說明該50μL中含有0.25OD的DNA，也即說明原來1ml母液中含有5OD的DNA。
2.怎樣溶解引物？
我們的的合成報告單給出了每OD引物稀釋為100μmoL/L（即100pmol/ul）濃度的加水量，您可以根椐您的實驗需要加入適量的無核酸酶的雙蒸水（PH>6.0）或TE緩衝液（PH 7.5-8.0），開啟瓶蓋溶解之前最好在3000-4000轉/分鐘的轉速下離心1分鐘，防止開蓋時引物散失。
3.合成的引物應如何保存?
沒有溶解的引物非常穩定，可以在-20℃下保存至少1年，溶解好的引物可以事先稀釋為100μmoL/L的儲存液，分裝數份保存於-20℃冰箱，可以保存至少半年以上（反覆多次凍融會降低使用壽命）。使用前，將濃溶液稀釋成工作液（10 pmol/ml或20 pmol/ml）後進行實驗。
4.如何檢測引物的純度？
實驗室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定濃度的聚丙烯醯胺凝膠進行電泳,<12個鹼基的引物用20%的膠，12-60個鹼基的引物用16%的膠，>60個鹼基的引物用12%的膠，取0.2OD左右的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素乾粉直到飽和，上樣前加熱變性(95oC,2mins)。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進行電泳，一定時間後(約2-3小時)，剝膠，用螢光TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的(有時由於變性不充分，主帶之上可能會有條帶，乃是引物二級結構條帶)。
5.一般的合成的引物在5和3末端有磷酸基團嗎?
沒有，5和3末端均為-OH基。如需要加磷酸基團，訂貨時請特別註明，此時需收取磷酸化的費用。
6.合成的引物進行PCR反應時無目的帶，怎麼辦?
PCR反應失敗的原因很多，可以從以下幾個方面考慮。
1) 引物和模板是否配對，同源性有多大?
2) 引物本身是否有立體結構.
3) PCR反應用試劑是否能正常工作?
4) PCR儀是否工作正常?
5) PCR反應條件是否合適?
如果一切正常，還無法解決問題時，我們可以免費重新合成引物。
7.測定了引物的OD值後發現A260/A280<1.8，引物的純度合格嗎?
由於核酸在260nm附近有強吸收，而蛋白質在280nm附近有強吸收，從生物體內提取核酸時，常用A260/A280比值來評價核酸純度(比值在1.8～2.0之間)，這一判斷是基於序列中A、G、C、T所佔比例大致相同時的結果。而合成的DNA/RNA則不同，序列很短 (通常在20～30個鹼基之間)，其中A、G、C、T各種鹼基所佔比例很不相同，由於各種鹼基的摩爾消光係數不同，因此不同鹼基構成的引物的A260/A280比值也不同，例如當序列中C、T鹼基的含量高時，該比值會大大低於1.8。所以不能用A260/A280的比值來判斷引物的純度.
8.如何將兩條互補的單鏈退火形成雙鏈？
用退火緩衝液(10mMTris, pH 7.5 - 8.0, 50mM NaCl, 1mM 13.2OD的引物可以多少做次PCR反應？ 一般來講，20個鹼基左右的2OD的引物最少可以做400次PCR反應。 15.引物在常溫下運輸，會降解嗎？ 不會降解，乾燥的引物在常溫至少可以穩定存放二周以上。而一般的運輸時間通常都在1-3天，所以您收到的引物不會降解。 EDTA)溶解引物, 將要退火的引物等摩爾數混合，總體積不要超過500微升，加熱到95℃ 2mins，然後緩慢冷卻至室溫(低於30度)即可。退火的產物可以放在4度待用。
9.使用3%的Agarose凝膠電泳分析合成的引物，發現有很多條泳帶，為什麼?
對引物進行電泳一定要使用變性PAGE電泳。由於引物是單鏈DNA，容易形成複雜的立體結構，因此進行Agarose電泳時，容易出現多條泳帶，更無法用Agarose電泳進行定量了。
10.能否根據引物電泳後EB染色後條帶的亮度對合成的引物進行定量?
不能。因為EB是通過嵌入到核酸的雙螺旋間而使其著色的。合成的DNA分子為單鏈，只有通過自身回折形成局部髮夾環結構或鏈間形成部分雙螺旋結構，才能被EB染色。由於不同引物的序列不同，形成雙螺旋的能力不同，因此染色能力不盡相同，也就不能根據EB染色帶的亮度來對合成的DNA進行定量。
11.2OD的引物可以多少做次PCR反應？
一般來講，20個鹼基左右的2OD的引物最少可以做400次PCR反應。
12.引物在常溫下運輸，會降解嗎？
不會降解，乾燥的引物在常溫至少可以穩定存放二周以上。而一般的運輸時間通常都在1-3天，所以您收到的引物不會降解。
13: 合成的螢光標記探針應如何保存?
1.螢光探針必須避光保存。
2.幹品請於-20℃保存。
3.強烈建議用RNase-free的TE (pH8.0) buffer溶解探針，這樣得到的探針溶液更穩定，保存時間更長。通常，將探針配製成100 pmol/ul的儲備液，分裝成幾份 (避免反覆凍融)，於-20℃保存。使用前，將配製好的儲備液稀釋成工作液 (10 pmol/ul或20 pmol/ul)，剩餘部分於-20℃保存。
14: 進行PAGE電泳時，長度完全一樣的Oligo DNA為什麼泳帶不在同一位置?
1.A、G、C、T的組份不同，電泳速度不同；
2.DNA的立體結構不同，電泳速度不同。這種情況在Oligo DNA越短時越容易發生，長鏈Oligo DNA之間差別較小。
15: PCR產物經克隆後測序發現，引物處的鹼基有錯誤，為什麼?
如果測序後引物處出現了問題，不排除PCR錯配的可能，但更主要的原因應在合成引物本身。在引物合成過程中，除了人為將序列輸錯 (可核對合成報告單)，化學合成方法本身不可避免地會產生失敗序列，具體分析如下：
1.由於DNA合成是從3′→5′端一個鹼基一個鹼基地連接上去的，每連接上一個鹼基，都需要多步化學反應 (Detritylation、Coupling、Capping、Oxidation)，我們稱之為一個循環。Coupling是上一個鹼基的5′OH 與下一個鹼基的3′活性部分發生偶聯反應，該反應的效率最高可達99%，即便如此，仍有1%的序列不能連接下一個鹼基，這些序列在經過Capping後脫離循環，成為缺鹼基的失敗序列；
2.Capping是將沒有連接上下一個鹼基的5′-OH乙醯化，阻止其進一步延伸。Capping的效率不可能達到100%，沒有被Cap的5′OH會進一步發生反應，造成中間缺鹼基的失敗序列；
3.Detritylation是將上一個鹼基5′OH上的保護基脫掉，準備連接下一個新鹼基，脫保護的效率也很難達到100%，沒有脫保護的5′OH會跳過該循環而直接進入下一個循環，造成中間缺鹼基的失敗序列；
4.在Coupling步驟中，新鹼基(活性狀態)在沒有與上一個鹼基發生偶聯反應前發生自身連接，造成多鹼基的失敗序列；
5.合成時鹼基G可能會轉化成烯醇式異構體，PCR擴增時被DNA聚合酶識別作A，發生 G到A的轉換。
上述各種原因產生的失敗序列可通過純化不同程度地得到去除。對40 mer以下的DNA製品，HPLC是最好的純化方法，其次是PAGE；而對40 mer以上的DNA製品PAGE純化要優於單純的HPLC純化。所以，如您要對PCR產物克隆後測序，一定要選擇PAGE純化或HPLC純化的引物。
16: PCR產物經克隆後測序發現，引物處的鹼基有錯誤，怎麼辦?
1.因為引物純度不可能是100%，因此，挑選克隆時，有可能挑選了雜質引物擴增出的PCR產物的克隆。此時，請重新挑選一個克隆測序，會得到正確的結果。
2.如果挑選2 ~ 3個克隆測序情況還沒改觀，我們會免費重新合成引物。
17: 進行蛋白表達實驗數個月不成功，後經測序發現引物處有錯誤，怎麼辦?
1.表達實驗之前一定要對DNA序列進行驗證。
2.我們可以免費重新合成引物。
3.如進行索賠時，按國際行業慣例，索賠範圍限於製品價格範圍之內。
18: G到A的轉換。上述各種原因產生的失敗序列可通過純化不同程度地得到去除。對40 怎樣才能保證Oligo DNA的正確性?
1.合成Oligo DNA時，選用高純度級製品。
2.避免使用過長的Oligo DNA，最好選用小於35 mer的合成DNA製品。
3.進行克隆實驗時，每次克隆都須進行測序驗證，以保證序列的正確性，然後再進行進一步實驗。進行蛋白表達實驗時，尤其需要注意。
19: 平端的PCR產物難以克隆，為什麼?
由於一般的PCR用引物的5′末端都沒有磷酸基團，因此，擴增後的PCR產物的5′末端也沒有磷酸基團。當克隆於去磷酸化的末端平滑載體時，無法克隆進去；而當克隆於非去磷酸化的末端平滑載體時，背景會極高。此時請對PCR產物的5′端進行磷酸 (PO4修飾) 化處理。
20: 進行反義核酸實驗時，是否要對DNA鏈全部進行S代修飾，除了S代外，還有什麼辦法可增加核酸在生物體內的穩定性?
DNA經S代修飾後比較穩定，在細胞中不會被核酸酶降解。如果整條鏈全部S代，的確能增加DNA的穩定性，但會降低其Tm值，也即降低該反義DNA與靶序列的結合效率。因此，科研人員一般採用將DNA片段兩端插入數個(通常3個)S代磷酯鍵Phosphorothioated Bonds)，這樣既能增加DNA的穩定性，又能增加反義DNA與靶序列的結合能力。不過如果要將反義DNA注入到活的動物體內，為增強穩定性，還是將整條鏈S代效果更好。
2』 O-Me (2』-OMe-RNA與RNA的親和力要比DNA與RNA的親和力大很多)。此外，5-Me-dC由於能增強DNA雙螺旋的穩定性，有時也被摻入到S代的反義核酸中。 RNA也阻抗核酸酶降解，可與S代DNA構成嵌合的反義核酸，這樣既能增強反義核酸的穩定性，又能增加其與靶序列的親和性 (2』-OMe-RNA與RNA的親和力要比DNA與RNA的親和力大很多)。
此外，5-Me-dC由於能增強DNA雙螺旋的穩定性，有時也被摻入到S代的反義核酸中。
21: FITC、6-FAM、5-FAM標記之間有何區別?
它們皆是螢光素標記 (Fluorescein)，三者結構間的區別如下：
從結構圖可見，5-FAM與6-FAM互為異構體；而FITC則在與Oligo的連接方式上(硫脲鍵) 有別於前者(醯胺鍵)，但它們的發色團均為螢光素，通常使用中沒有區別。
22: 淬滅基團為TAMRA、Eclipse或BHQ系列染料的雙標記螢光探針在使用上有什麼不同?
由淬滅基團TAMRA、Eclipse或BHQ系列染料組成的雙標記螢光探針常常被用作水解探針(Hydrolysis Probes)，或稱"TaqMan"探針，用於Real Time PCR實驗。由於這些淬滅染料的光譜學性質不同(見下圖)，作為淬滅基團使用時的特點也不同，現說明如下：
1.TAMRA為螢光染料，在淬滅報告基團的同時，自身會在更高波長處發射螢光，此發射螢光會對報告基團的檢測造成影響，探針螢光本底 (Background)相對較高。而Eclipse及BHQ系列為非螢光染料，淬滅報告基團，但自身不發射螢光，因此，探針螢光本底低，信噪比更大，檢測靈敏度更高。
2.淬滅基團對報告基團的淬滅有賴於二者的光譜迭蓋(Overlapping),也即報告基團的螢光光譜應與淬滅基團的吸收光譜相交搭。對比TAMRA、Eclipse及BHQ系列染料的吸收光譜，可見TAMRA的吸收光譜覆蓋範圍窄，可與之匹配的報告基團種類比較少；而Eclipse則具有更寬的吸收範圍(390 nm-625 nm)，可淬滅的報告基團種類很多，如FAM、HEX、TAMRA、ROX等均可；組合使用的BHQ系列染料的吸收光譜覆蓋範圍則更廣，從430 nm一直到近紅外，可淬滅的報告基團種類更多 (象Cy3、Cy5等的淬滅效果都很好)。因此可由Eclipse或BHQ系列染料組成一套雙標記螢光探針用於多重PCR(Multiplexing PCR)。
23: TaqMan 探針設計時應遵循哪些原則?
1.探針應位於兩引物之間；
2.探針中鹼基G、C的含量應在20%～80%之間；
3.避免同種鹼基成串出現，特別是鹼基「G」；
4.鹼基G不要出現在5』末端；
5.探針的Tm值要比引物的Tm值高8～10℃，應在68～70℃之間；
6.探針長度超過30個鹼基時，最好把淬滅基團放在中間，以防止螢光本底過高，這時探針的3』末端應加磷酸基封阻，以防探針在PCR反應過程中延伸。
24: 何謂分子信標 (Molecular Probes)？與普通的雙標記探針 (如TaqMan探針)相比，在使用上有什麼特殊性？
Molecular Probes是一類特殊的雙標記探針，通常狀態下，其兩末端互補配對，形成莖-環結構 (發卡環結構)，發卡環結構迫使分別連在兩末端的報告基團與淬滅基團緊密鄰近 (此時檢測不到螢光)，而一旦雜交到靶序列上，則報告基團與淬滅基團分開，Molecular Probes變得明亮起來，可檢測到螢光。由於發卡環結構的存在，探針對靶序列檢測的特異性增強，相對於普通的雙標記探針 (如TaqMan探針)，Molecular Probes對SNP有更強的識別能力，能區分序列上僅相差一個鹼基的靶序列，因此Molecular Probes常用於SNP檢測。此外，Molecular Probes也應用於活體細胞內的mRNA雜交、RNA加工、及轉錄過程的時時監測研究等。
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