陳苑秋，袁曉*，蒲含林*
暨南大學細胞生物學系 廣州牌牌生物科技有限公司
摘要：目的 為藥物中基因毒性雜質的分析方法開發及檢測提供參考。方法 查閱國內外文獻，歸納與總結了液相色譜及液質聯用技術在基因毒性雜質檢測中的適用範圍、特點與不足，並對其應用案例進行綜述。 結果與結論 基因毒性雜質種類繁多，需根據結構特性及限度要求開發合適的分析方法。液相色譜及液質聯用作為當代藥物分析的重要手段，在基因毒性雜質分析中具有廣闊的應用前景。
關鍵詞：基因毒性雜質；液相色譜；液質聯用；分析方法
Application of LC and LC-MS in the detection of genotoxic impurities
CHEN Yuan-qiu, YUAN xiao*, PU Han-lin*
Abstract：OBJECTIVE It provides a reference for the development and detection of genotoxic impurities in drugs. METHODS The application scope, characteristics and shortcomings of liquid chromatography and liquid chromatography mass spectrometry in the detection of genotoxic impurities were summarized. RESULTS AND CONCLUSION The application of these techniques in the analysis of genotoxic impurities was introduced. There are many kinds of genotoxic impurities and appropriate analytical methods should be developed according to the structural characteristics and limits. As an important means of modern drug analysis, liquid chromatography and the combination of liquid and mass have wide application prospects in the analysis of genotoxic impurities.
Keywords: Genotoxic impurity; Liquid chromatography; Liquid chromatography mass spectrometry; Analytical methods
基因毒性雜質（Genotoxic Impurities，GTIs），也稱遺傳毒性雜質，是指可與DNA反應，且在較低濃度時可能會直接造成DNA損傷，導致DNA突變的物質。潛在基因毒性雜質（Potential Genotoxic Impurities，PGIs）是指結構上與基因毒性雜質相似，具有一定的警示結構，但還未得到實驗證明的一類化合物。為了更好地控制基因毒性雜質，歐洲藥品管理局（EMA）、食品藥品監督管理局（FDA）和人用藥品註冊技術要求國際協調會議（ICH）相繼出臺了相關的指導原則，提出採用「毒理學關注閾值」（threshold of toxicological concern，TTC）作為基因毒性雜質的可接受限度，並根據TTC以及每日攝入劑量，計算藥物中基因毒性雜質的控制限度，即1.5（μg/d） / 最大日劑量（g/d）[1, 2]。由於基因毒性雜質種類繁多且控制限度不同，故需要根據結構特性及限度要求開發合適的檢測分析方法。本文系統地歸納了液相色譜及液質聯用技術在基因毒性雜質檢測中的適用範圍、優點及不足，總結了近年來國內外採用液相色譜及質譜技術在基因毒性雜質檢測中的應用，主要包括高效液相色譜-紫外檢測法、高效液相色譜-二極體陣列檢測法、超高效液相色譜法、二維液相色譜法、高效液相色譜-串聯質譜法及超高效液相色譜-串聯質譜法。
1.液相色譜法
1.1高效液相色譜-紫外檢測法（HPLC-UV）
高效液相色譜法（HPLC）因具有分離效率高、成本較低等特點，而在藥物雜質分析中得到廣泛應用[3]。在可達到檢測限度的情況下對常規限度較高，且對揮發性弱而紫外吸收強的基因毒性雜質可首選高效液相色譜法進行檢測。
孫以乙腈:0.02mol/ml磷酸鹽緩衝液（pH3.5）（50:50）為流動相，在波長225nm下檢測氫溴酸西序普蘭中的對甲苯磺酸乙酯，LOD為0.0124μg/mL，LOQ為0.0256μg/mL[4]。需通過調整有機相的比例及流動相的pH以改善分離度，最終確定以乙腈：10mmol/ml磷酸二氫鈉溶液（pH3.5）（10:90）為流動相，在波長242nm下檢測利伐沙班中的4-（4-氨基苯基）-3-嗎啉酮，LOD為10.10ng/mL，LOQ為30.30 ng/mL[5]。Griˇcar等以0.5g/L H3PO4-乙腈為流動相，在波長205nm下通過梯度洗脫程序對沙坦類藥物（厄貝沙坦、坎地沙坦、纈沙坦）中的疊氮化物進行分析，LOD為0.17μg/g，LOQ為0.84μg/g[6]。謝等以0.1%醋酸溶液-乙腈為流動相，在波長286nm下通過梯度洗脫程序檢測間苯三酚中的2,4-二氯苯酚及2,4,6-三氯苯酚，LOD均為0.5μg/mL，LOQ分別為1.5μg/mL和1.6μg/mL[7]。Luo等採用了HPLC-UV衍生化對氯黴素中的4-硝基苯甲醛進行測定，通過比較四種硝基苯瘟衍生化試劑，發現3-硝基苯肼與4-硝基苯甲醛在60℃乙腈-水（70:30）中反應30分鐘，藥物基質和衍生試劑的幹擾明顯減少，其衍生物的最大吸收波長顯著紅移至397nm，該方法的LOD 及LOQ分別為0.009μg/mL、 0.003μg/mL[8]。Zheng等在比較了硝基苯肼與硝基苯胺後，選擇2-硝基苯肼作為衍生劑，對親酯性藥物中的芳香族與脂肪族醯氯進行衍生化分析，檢測限的範圍為0.01-0.03μg/mL[9]。
HPLC-UV操作簡單、維護成本低，但對於無紫外吸收基團或紫外吸收弱的樣品，需進行衍生化處理，且HPLC-UV在使用時只能選擇固定的檢測波長，不適用於最佳檢測波長不確定的樣品。
(小結評價一下HPLC-UV法的局限性或範圍)
1.2高效液相色譜-二極體陣列檢測法（HPLC-DAD）
二極體陣列檢測器（DAD）可以對色譜峰進行光譜掃描、峰純度鑑定，在方法研究中可快速選擇最佳檢測波長，在高效液相色譜分析中廣泛使用，是物質鑑別的一種常用手段，已被證明是一種可靠的檢測方法[10, 11]。
García等在對氯芬斯汀芬地佐酯中的對甲苯磺酸甲酯（MPTS）、2-氯乙基對甲苯磺酸鹽（CEPTS）進行檢測時，發現MPTS出現峰強度下降的現象，且降解產物是一種未知的化合物，最終通過HPLC-DAD對MPTS的降解產物進行分析，得到與對甲苯磺酸匹配的保留時間與紫外光譜，從而確定是由於MPTS酯鍵發生降解而導致[12]。Soman等開發了一種簡單、靈敏的HPLC-UV-DAD方法，通過直接進樣的方式檢測雙原料藥中的4-氨基-2-乙氧基-肉桂酸、4-氨基-2-乙氧基-肉桂酸乙酯、4-溴-3-甲氧基-硝基苯， LOD為0.09 - 0.6µg/mL[13]。Hou等建立了在溫和條件下以2-硝基苯肼為衍生劑，測定藥物中滷代酸（氯乙酸，溴乙酸，二氯乙酸，2-氯丙酸，2 -溴丙酸和3-氯丙酸）殘留量的方法，並採用HPLC-DAD進行分析，檢測範圍在0.02-–0.05μg/mL[14]。
HPLC-DAD可通過全波長掃描獲得更全面的樣品信息，很好地彌補了HPLC-UV檢測波長單一的缺陷，並可根據光譜對未知化合物進行輔助定性。
(小結評價一下HPLC-DAD法與UV法的不同或優勢)
1.3超高效液相色譜法（UPLC）
作為HPLC的衍生產品，UPLC的出現無疑為藥物分析打開了新的大門。無論是分析速度、溶劑消耗量，還是色譜解析度和靈敏度，UPLC都優於傳統的HPLC[15, 16]。
Abdelwahab等建立了一種在輔料苯扎溴銨的存在下穩定測定氮卓斯汀中苯甲醯肼的UPLC-UV方法，LOD和LOQ分別為1.62µg/mL、4.91µg/mL[17]。在檢測鹽酸沙格雷酯中的中間體環氧化物時，Wang等比較了柱切換高效液相色譜法和超高效液相色譜法，發現超高效液相色譜法的檢測靈敏度更高，LOD和LOQ可達0.09ppm和0.18ppm，但由於鹽酸沙格雷酯中間體的幹擾，導致回收率較差[18]。
基於UPLC的優點，對於較難分離的基因毒性雜質可選擇該法，且因其分離速度快、分析時間短，在方法優化時可節省大量時間。
(小結評價一下UPLC法的可能應用範圍和優勢)
1.4二維液相色譜法（2D-LC）
二維液相色譜，也稱柱切換液相色譜，在一維液相的基礎上通過添加一組切換閥和一個樣品定量環而達到快速、高效分離複雜樣品的目的，用於基因毒性雜質分析時，不僅自動化程度高，還可降低基質影響，提高檢測靈敏度[19, 20]。
為檢測鹽酸沙格雷酯中的中間體環氧化物，Wang等開發了一種簡單經濟的柱切換色譜法，即選擇兩根保留較弱的色譜柱以減少鹽酸沙格雷酯中間體的殘留，色譜柱1的作用是儘可能多地從系統中除去鹽酸甲氧基胍中間體，並保留所有的環氧化合物雜質，色譜柱2的作用是分離從色譜柱1切換過來的少量鹽酸沙格雷酯中間體和全部的環氧化物雜質，達到準確定量環氧化物雜質的目的，該方法的LOD可達0.33ppm[18]。結合超高效液相色譜以及二維液相的優點，對於基質效應嚴重的基因毒性雜質，2D-UPLC可提供新的思路。
2. 液相色譜-質譜聯用檢測法
2.1高效液相色譜-質譜聯用檢測法（HPLC-MS）
對基因毒性雜質進行痕量分析時，需要一個可靠、靈敏度高且重現性高好的分析方法，這是對現代分析技術的一個重要挑戰，僅使用液相色譜難以滿足痕量分析，而液相色譜與質譜的聯用很好地結合了液相色譜的多功能性及質譜的靈敏性[21]，使基因毒性雜質痕量分析可以準確地測定至ppm乃至甚至更低的水平。
張等在電噴霧電離源（ESI）正離子模式下，採用多反應離子監測模式（MRM）——離子對採集方式對氟胞嘧啶中的N,N-二甲基苯胺進行測定，LOD 及LOQ分別為0.1ng/mL、0.4ng/mL[22]。Guo等採用液質聯用技術，比較了電噴霧電離源（ESI）與大氣壓力化學電離源（APCI）兩種電離技術對12種潛在基因毒性雜質（磺酸酯類）在檢測能力上的差異，結果發現採用ESI源時，無論是正模式還是負模式，靈敏度與重現性都較差，並且難以改善，採用APCI源時，正模式下檢測靈敏度較低，但在負模式下，可電離出穩定的子離子，準確度高，且在選擇反應監測模式（SRM）SRM模式下可達到較低的檢測限（2-4ng/mL）[23]。宋等建立了液相色譜-質譜法同時測定酒石酸伐尼克蘭中6個類苯胺雜質，因其中4個雜質為同分異構體，質譜離子反應特徵相同，因此通過優化流動相的pH及梯度洗脫程序使其有效分離，從而達到較高的的靈敏度，經過方法學驗證，LOD 及LOQ分別為15ng/mL、45ng/mL[24]。Székely等利用實驗設計（Design of Experiments，DOE）開發高效液相色譜串聯質譜法對4-二甲基氨基吡啶（DMAP）痕量分析的方法，研究了流速、梯度、進樣量三個液相條件及錐孔電壓、碰撞能兩個質譜參數，並根據分離度、峰面積、分析時間、信噪比進行色譜及質譜條件優化，其定量限可達0.1ppm[25]。Grigori等在檢測美羅培南的三種潛在基因毒性雜質時，通過設置質譜切換閥將在三種雜質後出峰的美羅培南切換至廢液，以減少原料對結果分析的幹擾[26]。（補充總結式說明該方法的應用範圍和優勢）
不同於LC-UV/DAD，使用質譜時不需考慮化合物是否具有發色基團，質譜數據可提供如分子量、結構特性、純度等有效信息[27]。當API中包含的其他雜質與目標基因毒性雜質在液相色譜中的保留時間相同或相近時，可能會對目標基因毒性雜質的測定產生幹擾，若單獨使用液相色譜可能無法作出準確判斷，此時採用液質聯用技術可以很好地排除這種幹擾。
2.2超高效液相色譜-質譜聯用檢測法（UPLC-MS）
超高效液相色譜與質譜聯用時可顯著縮短檢測時間及並減少溶劑使用量，提高離子質譜化效率並減小基質效應，使靈敏度和重現性提高[28]。
Venugopal在開發一種可同時測定利託那韋中三種苯酚雜質的UPLC-MS方法時，研究了不同稀釋劑的色譜性能，發現用甲醇-水（40:60）作為稀釋劑時可解決雜質響應低且峰形差的問題，減少了基質對靈敏度、回收率及重現性的影響，LOD可達0.03-0.1ppm，LOQ為0.1-0.3ppm[28]。Marija等在對齊帕西酮五種未知降解物進行定量測定及遺傳毒性結構鑑定時，通過優化色譜條件對結構相似性較高的化合物進行分離，使七種化合物在七分鐘的運行時間內完成洗脫，同時優化MS/MS裂解條件獲得特定的裂解片段並提高信號強度[29]。Vijaya等開發出一種靈敏且選擇性強的UPLC-MS/MS方法同時鑑定和定量佐米曲普坦中的四個PGI，解決了用HPLC分析該藥物雜質時間長和分離效率低的問題[30]。（簡單總結該方法的優缺點）
鑑於UPLC能有效分離和分析複雜的樣品的優點，當HPLC-MS無法很好地分離含基因毒性雜質的複雜樣品時，可考慮採用UPLC-MS。
2.3 二維液相-質譜聯用檢測法（2D LC-MS）
考慮到流動相中的非揮發性添加劑對質譜的損害和汙染，John等採用柱切換液相色譜分離技術通過不同的洗脫液對複雜混合物的成分進行分離，增強了質譜檢測的能力，成功提高對低含量目標化合物的檢測和表徵[31]。3-硝基苯並蒽醌（3-NBA）是一種潛在基因毒性雜質，Hasei等開發了一種新的靈敏的分析方法，採用反相色譜和正相色譜組成的二維HPLC系統，通過反相色譜純化3-NBA，用填充氧化鋁的催化劑柱在乙醇中將非螢光的3-NBA還原成螢光3-氨基苯並蒽醌（3-ABA），但3-NBA在乙醇中不發螢光，因此，通過正相色譜將3-ABA與乙醇和雜質分離，並用螢光檢測器進行定量檢測[32]。（補充小結該法的優點和可能應用範圍）
由於質譜對流動相成分的要求較高，使用二維液相色譜與質譜聯用時可通過改變二維洗脫條件，避免第一維分離條件中的不揮發性添加劑等進入質譜，並減少其他雜質的幹擾，提高質譜檢測信號。
（能不能列個表總結一下各種方法的優缺點和使用範圍？）
結語
隨著液相色譜與液質聯用技術的發展，其在基因毒性雜質檢測中的應用越來越廣泛。對基因毒性雜質檢測進行方法開發時，需根據基因毒性雜質的其特性及限度需要要求選擇合適的檢測方法。，如需對基因毒性雜質進行痕量分析時，儘管液相色譜操作簡便且維護成本低，但其檢測限度可能無法滿足要求，且原料中包含的其他雜質常常會對目標雜質產生幹擾，容易出現假陽性或回收率差的問題，而質譜不僅靈敏度高且抗幹擾能力強，將二者串聯使用能達到更準確快速地分析。而二維液相色譜與質譜聯用時，可有效避免流動相中的某些成分（如不揮發性鹽、不揮發性酸等）對質譜的損壞及對pH對電離效率的影響。因此，液相色譜及液質聯用作為當代藥物分析的重要手段，在基因毒性雜質分析中具有廣闊的應用前景。
現有方法的評價，是不是夠用了，還有哪些不足之處或不能滿足的方面。
適用範圍
適用於常規限度、揮發性弱而紫外吸收強的基因毒性雜質
適用於最佳檢測波長不確定的基因毒性雜質
適用於分析時間長且較難分離的基因毒性雜質
適用於基質效應嚴重的基因毒性雜質
適用於無發色基團或需痕量分析的基因毒性雜質
適用於難分離且分析時間長的複雜樣品
適用於基質效應嚴重及需在含不揮發性鹽流動相下分離的基因毒性雜質
優點
操作簡單、維護成本低
1.可進行光譜掃描、峰純度鑑定
2.可快速選擇最佳檢測波長
1.分析速度快、分析時間短
2.溶劑消耗量低
3.色譜解析度高
1.自動化程度高
2.基質影響小，檢測靈敏度高
1.不需考慮化合物是否具有發色基團
2.可排除API中與目標基因毒性雜質在液相色譜中保留時間相同或相近的其它雜質的幹擾
1.分析速度快、分析時間短
2.溶劑消耗量低
3.色譜解析度高
4.離子質譜化效率高
1.避免流動相中非揮發性添加劑對質譜的損害
2.降低交叉幹擾、減少信號抑制
3.利用二維改變洗脫條件提高質譜檢測信號
不足
1.只能選擇固定的檢測波長
2.對於無紫外吸收基團或紫外吸收弱的基因毒性雜質，需進行衍生化處理
對於無發色基團的基因毒性雜質，需進行衍生化處理
不適用於基質效應嚴重的基因毒性雜質
無法滿足痕量分析
不適用於難分離的複雜樣品
不適用於基質效應嚴重的基因毒性雜質
操作較繁瑣
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