Nitric oxide modulates bone anabolism through regulation of osteoblast glycolysis and differentiation
作者：Zixue Jin, Jordan Kho,Brian Dawson, Ming-Ming Jiang, Yuqing Chen, Saima Ali, Lindsay C. Burrage, Monica Grover, Donna J. Palmer, Dustin L. Turner, Philip Ng, Sandesh C.S. Nagamani, and Brendan Lee(Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, Houston, United States of America.)
發表情況：J Clin Invest. 2020. https://doi.org/10.1172/JCI138935.
先前的研究表明，一氧化氮(NO)補充劑可以預防雌激素缺乏的臨床前模型中的骨丟失和骨折。然而，NO調節骨合成代謝的機制在很大程度上仍不清楚。
1. 在成骨細胞譜系中缺失ASL可導致NO的產生、成骨細胞分化和礦化的減少。
2. 成骨細胞譜系中缺失Asl導致糖酵解途徑下調。
3. 雜合缺失Cav-1可以恢復NO的生成和糖酵解能力。
4. Cav-1雜合子缺失部分地挽救了AslNeo/Neo小鼠的低骨量。
5. 成骨細胞譜系中ASL缺失導致成骨細胞分化和功能受損，從而導致骨量減少。
先前的研究表明，一氧化氮(NO)補充劑可以預防雌激素缺乏的臨床前模型中的骨丟失和骨折。然而，NO調節骨合成代謝的機制在很大程度上仍不清楚。精氨酸琥珀酸裂解酶(ASL)是唯一能夠合成精氨酸的哺乳動物酶，是一氧化氮合酶(NOS)依賴的NO合成的唯一前體。此外，ASL還需要引導細胞外精氨酸到NOS以產生NO。因此，ASL缺乏(ASLD)是一種研究細胞自主、NOS依賴的NO缺乏的模型。在這裡，我們報導ASL的缺失導致NO的產生減少和成骨細胞分化的損害。機械地說，骨表型至少在一定程度上是由NO介導的成骨細胞糖酵解途徑激活的缺失導致成骨細胞分化和功能下降。雜合缺失的小窩蛋白-1，一種NO合成的負調節因子，恢復了NO的生成，成骨細胞分化，糖酵解和ASLD小鼠模型的骨量。對ASLD患者誘導多能幹細胞(iPSCs)進行的研究進一步重申了這些臨床前研究的轉化意義。綜上所述，我們的研究結果表明ASLD是研究非依賴性成骨細胞功能的一種獨特的遺傳模型，非糖酵解途徑可能是調節骨合成代謝的新靶點。
Previous studies have shown that nitric oxide (NO) supplements may prevent bone loss and fractures in preclinical models of estrogen deficiency. However, the mechanisms by which NO modulates bone anabolism remain largely unclear. Argininosuccinate lyase (ASL) is the only mammalian enzyme capable of synthesizing arginine, the sole precursor for nitric oxide synthase (NOS)-dependent NO synthesis. Moreover, ASL is also required for channeling extracellular arginine to NOS for NO production. ASL deficiency (ASLD) is thus a model to study cellautonomous, NOS-dependent NO deficiency. Here, we report that loss of ASL led to decreased NO production and impairment of osteoblast differentiation. Mechanistically, the bone phenotype was at least in part driven by the loss of NO-mediated activation of the glycolysis pathway in osteoblasts that led to decreased osteoblast differentiation and function. Heterozygous deletion of Caveolin-1, a negative regulator of NO synthesis, restored NO production, osteoblast differentiation, glycolysis, and bone mass in a hypomorphic mouse model of ASLD. The translational significance of these preclinical studies was further reiterated by studies conducted in induced pluripotent stem cells (iPSCs) from an individual with ASLD. Taken together, our findings suggest that ASLD is a unique genetic model for studying NOdependent osteoblast function and that the NO-glycolysis pathway may be a new target to modulate bone anabolism.
圖1. 在成骨細胞譜系細胞中，Asl缺失導致NO的產生、成骨細胞分化和礦化降低
(A)在si-RNA介導的ST2細胞中，通過DAF-FM螢光強度檢測NO水平。n=8。(B)通過qPCR檢測ST2細胞中Asl、Runx2、Osx、Alp和Col1a1 mRNA水平。Asl基因敲除ST2細胞後在成骨培養基中分化3天。n=4。(C)通過qPCR檢測WT和AslNeo/Neo小鼠BMSC來源的成骨細胞中Asl、Runx2、Osx、Alp、Col1a1和骨鈣素(Ocal)的mRNA水平。骨髓間充質幹細胞在成骨培養基中培養14天。n=3。(D) WT和AslNeo/Neo小鼠BMSC源性成骨細胞茜素紅染色。骨髓間充質幹細胞在成骨培養基中培養14天。n = 3。數據用平均SD表示。Student s t test. * P<0.05; ** P<0.01; ***P<0.005.
圖2. 成骨細胞譜系細胞中Asl的缺失導致糖酵解通路的下調
(A)利用RNA-seq在WT和AslNeo/Neo小鼠的BMSC源性成骨細胞中檢測到前200個差異表達轉錄本(100個上調和100個下調)的熱圖。骨髓間充質幹細胞在成骨培養基中培養14天。n=3。(B) WT和AslNeo/Neo小鼠BMSC源性成骨細胞糖酵解通路相關基因下調的熱圖。(C)western blot檢測PFKFB3、PKM和LDHA的蛋白水平，以及(D) WT和AslNeo/Neo BMSC源性成骨細胞的western blot定量。n=3(E)western blot檢測PFKFB3、PKM和LDHA蛋白水平，以及(F)WT和AslNeo/Neo小鼠長骨蛋白提取物的western blot定量。n=4。(G-H)海馬糖酵解活性(ECAR)在si-RNA介導的ST2細胞Asl敲低，5µM NO供體S-亞硝基-N-乙醯青黴胺(SNAP)或5µM DMSO (Vehicle)處理18小時。(n=6-10，數據代表三個獨立的實驗)數據用均值SD表示。Student's t檢驗(對D和F)和雙向方差分析，Tukey的多重比較檢驗(對H)。* P<0.05; ** P<0.01; ***P<0.005; ns: not significant P>0.05.
圖3. Cav-1雜合缺失可恢復NO的產生和糖酵解能力(A)Asl和Cav-1調控NO合成的示意圖
(B)WT和AslNeo/Neo小鼠BMSC源性成骨細胞Cav-1 mRNA和(C-D)蛋白水平。骨髓間充質幹細胞在成骨培養基中培養14天。n=3-4。(E) WT、AslNeo/Neo和AslNeo/Neo的DAF-FM螢光強度;Cav-1+/-小鼠來源的BMSCs。n=12 細胞/鼠。數據代表了兩個獨立的實驗。(F) WT、AslNeo/Neo、AslNeo/Neo、Cav-1+/-小鼠BMSC源性成骨細胞糖酵解基因Slc2a1、Pfkfb3、Aldoc和Ldha的mRNA水平。骨髓間充質幹細胞在成骨培養基中培養14天。n = 3-4。(G-H) WT、AslNeo/Neo和AslNeo/Neo中ECAR的海馬分析;Cav-1+/-小鼠BMSC源性成骨細胞。n=12細胞 /鼠。數據代表三個獨立的生物重複。
圖4. Cav-1雜合子缺失部分地挽救了AslNeo/Neo小鼠的低骨質量
(A)茜素染色(B)通過對WT、AslNeo/Neo和AslNeo/Neo的BMSC源性成骨細胞的qPCR檢測Ocal和Col1a1 mRNA水平;Cav-1+/-小鼠。骨髓間充質幹細胞在成骨培養基中分化14d。n = 3-4。(C)WT、Cav-1+/-、AslNeo/Neo和AslNeo/Neo股骨遠端CT分析;Cav-1+/-小鼠(n=5-7)。雄性，產後21天23天。BV/TV，骨體積/組織體積比。Tb.N ,骨小梁數目; Tb.Th,骨小梁厚度; Tb.Sp,骨小梁的分離度;Conn.D,連接密度；Cort.Th,皮質厚度。數據用平均SD表示。單因素方差分析，然後是Tukey的多重比較測試。* P<0.05; **P<0.01; ***P<0.005; ns:not significant P>0.05.
圖5. 成骨細胞譜系中Asl缺失導致骨形成減少導致骨質量下降
(A) WT (Aslflox/flox)和Ocn-Asl cKO小鼠遠端股骨的CT分析。3個月雄性小鼠股骨遠端骨參數。 (B-D) 3月齡雄性WT (Aslflox/flox)和Ocn-Asl cKO小鼠股骨遠端組織形態學分析。(B)成骨細胞數量/骨表面(N.Ob/BS)(C)雙鈣黃素標記動態成骨。骨形成率(BFR/BS);礦物沉積率(MAR)。(D)破骨細胞參數，破骨細胞表面/骨表面(Oc.S/BS)和破骨細胞數量/骨表面(N.Oc/BS)。n = 6-8 /組。數據用平均SD表示。
圖6. ASL缺乏對ASLD患者成骨細胞功能和骨密度的影響
(A)糾正ASLD患者複合雜合突變的每個變體的示意圖。(B)茜素紅染色ASLD和2株等基因對照iPSC，在成骨培養基中分化21d。n=3。(C)成骨細胞標記基因Runx2、Col1a1和(D)糖酵解基因Slc2a1、Hk1、Hk2、Pfkfb3、Pkm和Ldha在成骨培養基中分化(iPSCs)前和(iPSCs-obs)後14d的mRNA水平。n=3。(E)western blot檢測GLUT1蛋白水平。n=3。誘導多能幹細胞在成骨培養基中分化14天。n=3。(F)通過qPCR檢測糖酵解基因Slc2a1, Hk1, Hk2, Pfkfb3, Pkm和Ldha的mRNA水平。來自ASLD的誘導多能幹細胞在成骨培養基中分化，用5M DMSO或5M SNAP處理12天。n=3。數據用平均SD表示。Student's t test. * P<0.005.(G)12例ASLD患者的aBMD Z-得分L1-L4點圖。兩名患者骨密度低(L1-L4 Z-得分低於-2.0)。
NO在NOS KO小鼠骨代謝中的作用已被研究，並有少量臨床試驗。精氨酸琥珀酸裂解酶(ASL)是唯一能夠合成精氨酸的哺乳動物酶，是一氧化氮合酶(NOS)依賴的NO合成的唯一前體。本文使用了多種模型系統，包括成骨細胞系中的ASL敲除、ASLD的半形小鼠模型、ASLD的成骨細胞特異性KO模型、ASLD個體誘導多能幹細胞生成的人成骨細胞，以及來自ASLD患者樣本的臨床骨數據。研究結果發現，成骨細胞中ASL的缺失會導致NO生成的減少、成骨細胞分化和功能的損害以及骨量的減少。而在海馬實驗中，作者觀察到S-亞硝基-N-乙醯青黴胺（SNAP）處理後部分挽救了ASL敲低的ST2細胞的糖酵解率，表明細胞自主和生理水平的NO可能促進成骨細胞譜系細胞線粒體氧消耗。作者還發現Cav-1雜合子缺失導致NO的產生增加，克服了ASLD背景下的NO缺失；AslNeo/Neo;Cav-1+/-小鼠的骨量部分恢復，伴隨糖酵解基因表達的逆轉。這表明，操縱NO產生的負與正調節因子的平衡可能是一種調節NO介導骨代謝的治療方法。