Jennifer Doudna
CRISPR-Cas系統作為基因組編輯和調節的編程工具，可以在各種細胞中（包括人類細胞）進行遺傳操作。雖然目前科學家們的注意力主要集中在CRISPR-Cas系統治療孟德爾
遺傳疾病方面的潛力，但是該技術還有望為複雜的體細胞疾病提供新的治療方法，同時CRISPR-Cas通過加速藥物靶點的鑑定和驗證，成為下一代藥物研發的有利工具。
近日CRISPR先驅——「女神」Jennifer在nature再發新成果，她的研究小組發現了兩個CRISPR新系統，十分振奮人心。由此可見CRISPR自問世以來總是帶給人們驚喜不斷，可謂引發了
遺傳學等生物學科研究和醫藥領域的革命。
12月23日《Nature Reviews Drug Discovery》在線發表的文章，Jennifer也參與其中，此次她們將目光投向CRISPR-Cas系統帶來的藥物發現途徑和疾病治療方案的革新。CRISPR-Cas系統指的是聚簇規則間隔短回文重複序列（clustered regularlyinterspaced short palindromic repeat ，CRISPR）和CRISPR相關蛋白（CRISPR-associated protein，Cas），能夠在哺乳動物模型系統和人體組織中快速而準確地改變基因組信息。通過對患者的體細胞進行直接編輯，引入校正突變或修飾調節元件，使幾乎所有靶點的藥物開發都成為可能。
CRISPR-Cas系統簡要地概括就是sgRNA指導Cas9核酸內切酶在同源位點誘導雙鏈斷裂，然後通過細胞DNA修復機制進行修復，包括NHEJ和HDR兩種途徑。 NHEJ最常用於破壞基因序列，而HDR可以用於通過設計的修復模板在特定基因座引入或改變
遺傳信息。催化失活的突變體Cas9可以融合到各種效應結構域以活化或抑制靶基因的轉錄，分別被稱為CRISPRa和CRISPRi的策略。
┃CRISPR-Cas作為藥物發現的工具
1建立精確的細胞模型（應用於藥物靶點發現）
DNA測序的發展及其大規模應用刺激了「個性化」或「精準」醫學的發展。雖然可在細胞之間比較某個基因（例如TP53，MYC或KRAS）的突變狀態，但通常會有許多其它混雜的特徵掩蓋了基因型和疾病類型之間的直接關係。研究人員可以使用來自患者和正常人群組織樣品進行比較，或者通過過度表達適當cDNA的技術，但是這些原始的技術會耗費大量勞動力和時間，這阻礙了它們廣泛應用於藥物開發。
CRISPR-Cas基因編輯的出現戲劇性地改變了這個狀況。通過CRISPR-Cas進行基因敲除已被證明用於幾乎所有的細胞類型，包括誘導多能
幹細胞（
ipsCs），癌症特異性免疫細胞。這種基因敲除允許研究人員在確定的背景下快速確定致癌基因、
腫瘤抑制因子和其他因子的致病作用。類似地，通過HDR「敲入」突變等位基因，研究人員可以測試疾病相關等位基因突變的作用，如與多種癌症相關的KRAS等位基因的研究，能夠分析突變體對疾病發展的影響或驗證突變體靶向治療候選物的特異性。
HDR需要以病毒
載體、質粒（編碼Cas9和sgRNA）或Cas9-sgRNA核糖核蛋白（RNP）複合物的形式遞送Cas9-sgRNA複合物以及DNA修復模板。雖然CRISPR-Cas敲除在幾乎任何細胞中都有效，但是效率隨細胞類型而變化。在非傳染性人類細胞（包括神經元）中實現中等水平的HDR是困難的。這些障礙使人沮喪，於是科學家們繞過HDR途徑，使用非同源或微生物介導的方式實現了在非有絲分裂人細胞中的應用。另一個令人興奮的發展是應用具有額外功能的Cas酶，可以直接改變靶鹼基，來實現無模板的精確特異性突變的引入。實現這一目標的重要方法是各種胞苷脫氨酶與Cas9的融合。
2快速生成動物模型（推動新藥動物實驗發展）
除了細胞培養應用之外，基因編輯已經極大地改變了產生疾病的動物模型的能力。在CRISPR-Cas工具最初發展之後不久，它就被用於產生具有多個
遺傳突變的小鼠。CRISPR-Cas可以在單個步驟中靶向多個基因，快速產生雙突變和多突變小鼠，但是必須注意的是這些等位基因要在育種後不依賴孟德爾分離。通常通過在受精卵中進行顯微注射或簡單電穿孔實現有效的CRISPR-Cas編輯技術（包括NHEJ 和HDR），而不需要使用傳統的胚胎
幹細胞操作的方式。在受精卵中進行基因編輯省去了分離、培養和編輯ES細胞的步驟，節省了時間，且加速了在現有動物模型中產生額外突變的進程。然而，通過受精卵編輯引入大量轉基因或複雜的多組分系統仍然是低效的，所以ES細胞中的基因靶向仍然是產生具有這種突變的動物所選擇的方法。
總體而言，CRISPR-Cas通過減少生成目標模型所需的時間不斷革新小鼠
遺傳學。目前，使用基於病毒或轉座子的
載體，CRISPR-Cas已經可以在某些組織中直接引入體細胞突變，例如肺和肝組織。這種方法被用於創建癌症和其他疾病模型。
靶向的CRISPR-Cas是具有巨大的前景的。傳統的基因靶向在小鼠以外的臨床前模型中仍然困難，而 CRISPR-Cas編輯已經在大鼠、狗和猴中進行，這些動物在臨床前藥物發現和開發期間都是常用的。靈長類動物中疾病模型的產生，例如恆河猴Duchenne肌營養不良的模型，進一步強調基因編輯可用於測試治療化合物的功效和安全性。
應用CRISPR建立動物模型過程
┃CRISPR-Cas提供新的治療方案
1應用於CAR-T細胞治療
隨著癌症免疫治療領域的快速擴大，基因編輯在體細胞疾病的應用集中在下一代嵌合抗原受體（CAR）T細胞的生產。
CAR包含細胞外結合結構域（目前為單鏈可變片段），能識別在腫瘤細胞上強烈表達和特異的抗原，激活T細胞的細胞內信號傳導，促進T細胞介導的
腫瘤細胞殺傷。第一批CAR-T細胞介導的治療靶向CD19，一種B細胞和相關癌細胞表達的抗原，幾種這些療法已經進入
臨床試驗（Juno Therapeutics：NCT02535364和NCT02631044； Kite Pharma：NCT02601313和NCT02348216；Novartis：NCT02030834和NCT02445248）。目前，大多數CAR-T細胞使用每個患者自身的T細胞產生，涉及為每個新患者分離、修飾和擴增T細胞。因此，CAR-T細胞的經濟性比基於抗體的檢查點的癌症免疫療法（例如ipilimumab，pembrolizumab和nivolumab）更不好。如果可以產生通用供體CAR-T細胞，則CAR-T細胞治療可以變得更快，更便宜。然而， CAR-T細胞識別受體細胞引起的移植物宿主排斥，仍然是現有方法的主要障礙。
CRISPR-Cas可以用於敲除內源性T細胞受體基因防止宿主反應性，也可以用於消除或減少供體T細胞上的組織相容性抗原的表達來預防或延遲受試者免疫系統對CAR-T細胞的排斥。此外，基因編輯還可以用通過敲除編碼T細胞抑制性受體或信號分子的基因，如細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4（CTLA4）或程序性細胞死亡蛋白1（PD-1）來促進CAR-T細胞功效。
美國國家衛生研究院（NIH）重組DNA諮詢委員會（RAC）最近批准了將在賓夕法尼亞大學進行的
黑色素瘤靶向CAR-T臨床試驗，其中Cas9將用於敲除細胞編碼PD1和內源性T細胞受體基因。中國最近開始了CRISPR-Cas的第一次
臨床試驗。該試驗使用Cas9敲除患有肺癌的個體的T細胞中的PD-1。而類似的試驗，用於前列腺和膀胱癌以及腎細胞癌的PD-1敲除T細胞也正在開始。
2離體基因編輯治療
向細胞或組織遞送藥物是非常挑戰性的，是藥物治療的主要限制。CRISPR-Cas的應用，對靶細胞進行體外操作，則規避了這個問題。造血系統是離體基因編輯的極好的靶標，因為細胞容易從外周血樣品獲得，並且可以在操作和擴增後重新注射。例如研究人員使用ZFNs破壞從HIV患者中分離的T細胞中的CCR5基因，隨後進行擴增，再重新回輸編輯的T細胞，以在患者體內產生HIV抗性的自體T細胞。這種方法的I / II期
臨床試驗正在進行中。儘管T細胞中CCR5基因的突變是永久的，但T細胞本身不是。研究人員最近正致力於破壞HSCs中的CCR5，以產生長期自我更新的HIV抗性細胞。
總之，CRISPR-Cas編輯可以加速功能
基因組學發展，揭示細胞機制並確證新的藥物靶點，開發更好的用安全性測試的模型，以及改善治療方案等。快速基因編輯也可以生成定製的自體細胞治療，包括癌症治療的T細胞和重新編程的
ipsC，應用於非
遺傳性疾病創新療法。雖然CRISPR-Cas系統將進一步改進，但我們相信基因編輯已開始對全世界的藥物發現和開發產生直接的影響。
原文來源：
Cornerstones ofCRISPR–Cas in drug discovery and therapy
相關會議推薦
2017模式動物與重大疾病動物模型研究與應用研討會
會議時間：2017.3.24 -3.25 會議地點：上海
會議詳情： http://www.bioon.com/z/2017model_organism/