ICL經驗 | 一文讀懂PCR實驗室建設關鍵點

4月26日，國家衛健委舉辦全國視頻會議，明確提出「所有縣區級以上疾控機構、二級以上綜合醫院要抓緊進行改造，在短時間內形成核酸檢測能力」。

各地的公立機構檢測能力不能滿足需求只是暫時的，獨立醫學實驗室在充實檢測力量的同時，發揮自己豐富的檢驗管理運營理念，以及區域化覆蓋的經驗優勢，融入到「國家隊」核酸檢測能力的建設中，順勢而為，乘勢而上。

隨著各地都在建立PCR實驗室，本文從硬體基礎的角度，梳理了PCR實驗室建設的幾個關鍵點，獨立醫學實驗室可以運用豐富的運營經驗，進行建設指導、人員梯隊建立、質控體系搭建、區域化服務支持等。

如何建設PCR實驗室

與PCR實驗室建設相關的指導文件主要有四份：

《醫療機構管理條例》

《醫療機構臨床實驗室管理辦法》

《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》

《醫療機構臨床基因擴增實驗室管理辦法》

要求臨床PCR實驗室，不但在實驗室設置及儀器設備等硬體上要滿足開展臨床檢驗的條件，而且要求實驗室在日常工作要有文件化的工作程序。

下面就在PCR實驗室建設過程中的幾個關鍵控制點進行闡述:

01 建立PCR實驗室質量管理體系

根據實驗室的具體情況編寫質量體系文件，《質量手冊》、《程序文件》、《作業指導書》，並保證管理體系運行有效。

管理體系的特點是應有明確的目的、規範的管理、有效的制約、高效的機制、能自我發展的整體。

建立完善的SOP文件，對完成各項質量活動的方法作出規定，每個SOP都應對一個或一組相互關係的活動進行描述。

每個SOP文件應說明該項質量各環節的輸入、轉換和輸出所需的文件、物資、人員、記錄以及它們與有關活動的接口關係。

明確每個環節轉換過程中各項因素的要求，即由誰做、做什麼、做到什麼程序、達到什麼要求，如何控制、形成什麼記錄和報告，以及相應的審批手續。

規定在質量活動中需要注意的例外或特殊情況的糾正措施。SOP應簡練、明確和易懂並且工作人員熟練掌握和嚴格遵守。

02 PCR實驗室的相關設置

要完成一組PCR實驗，通常需要經過試劑配製、樣品處理、核酸擴增和產物分析4個實驗過程。

這4個實驗過程的實驗用房應相鄰布置，組成一個獨立的PCR實驗區。標準的PCR實驗區包括:試劑準備區、標本製備區、擴增區、產物分析區、各區配套的緩衝區及公共走廊。

PCR實驗室整體平面布局

某醫院PCR實驗室平面布局如圖1所示，整個區域有一個公用走廊，每個獨立實驗區設有專門的緩衝區。通過壓差控制，使整個PCR實驗過程中試劑和標本免受氣溶膠的汙染，並且降低擴增產物對人員和環境的汙染。

圖表1、某醫院PCR實驗室平面圖

試劑準備區

該實驗區主要進行的操作為貯存試劑的製備、試劑的分裝和主反應混合液的製備。

試劑和用於標本製作的材料應直接運送至該區，不得經過其他區域。試劑原材料必須貯存在本區內，並在本區內製備成所需的貯存試劑。

試劑準備區配備有2~8°C冰箱和-80°C冰箱，計算冷負荷時，需要將它們計算在內。

房間的面積宜控制在15m2~20m2。本區的壓力梯度要求為:相對正壓狀態，以防止外界含核酸氣溶膠的空氣進入，造成汙染。

標本製備區

該區域主要進行的操作為臨床標本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定RNA時cDNA的合成。

標本製備區配備有2~8°C冰箱和-20°C冰箱，計算冷負荷時，需要將它們計算在內。在標本製備區，還需要配備生物安全櫃，用於進行提取核酸的操作。

為避免提取的核酸在櫃內反覆循環，造成標本之間的交叉汙染，出現假陽性結果，該區域配備的生物安全櫃必須是B2型的。生物安全櫃工作區垂直氣流全部來自實驗室，排風經過高效過濾器過濾後直接排至室外，不允許回到安全櫃和實驗室中。

根據經驗，如果實驗室內配備生物安全櫃，每配備一臺，實驗室的面積增加10m2;標本製備區的面積宜在25m2~30m2之間。本區的壓力梯度要求為:相對於鄰近區域為正壓，以避免從鄰近區進入本區的氣溶膠汙染。

擴增室

該區域主要進行的操作為DNA或cDNA擴增。此外，已製備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本製備區)的加入和主反應混合液(來自試劑貯存和製備區)製備成反應混合液等也可在本區內進行。

在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴增後必須打開反應管，因此巢式擴增有較高的汙染危險性，第二次加樣必須在本區內進行。

擴增室主要配備PCR實驗室的核心儀器PCR儀，本文實例中使用了ABI7500和ABI9700兩種PCR儀。

在實驗室建造過程中，需要給PCR儀配備專門的UPS電源，以保證其正常工作。該區面積控制在15m2~20m2。

本區的壓力梯度要求為:相對於鄰近區域為負壓，以避免氣溶膠從本區漏出。為避免氣溶膠所致的汙染，應儘量減少在本區內的不必要的走動。個別操作如加樣等應在超淨臺內進行。建議採用5~10Pa壓差，在控制上比較容易實現。

產物分析區

該區域主要進行的操作為擴增片段的測定。如使用全自動封閉分析儀器檢測，此區域可不設。

在室內配備通風櫥，保證房間內的相對負壓，空氣從室外流向室內。該區面積控制在15m²~20m²。

本區是最主要的擴增產物汙染來源，因此對本區的壓力梯度的要求為:相對於鄰近區域為負壓，以避免擴增產物從本區擴散至其它區域。建議採用5~10Pa壓差，在控制上比較容易實現。

03 正負壓區域緩衝室的設置

根據壓力梯度的要求，試劑配製室和樣品處理室為相對正壓，擴增室和產物分析室為相對負壓，要求正壓的區域和要求負壓的區域的緩衝室內的壓力設計大不相同。

正壓緩衝室符合一般正壓潔淨室的緩衝原則，主要是防止室外環境空氣中的氣溶膠進入室內。正壓緩衝室的布置如圖2所示。

圖表2、正壓緩衝室的布置圖

負壓緩衝室則是要求緩衝室對核酸擴增室及產物分析區保持正壓，對緩衝室外也保持正壓(主要是滿足室內淨化需要，如室內無潔淨要求，此處可以為0壓)。負壓緩衝室的布置如圖3所示。

圖表3、負壓緩衝室的布置圖

04 汙染的預防與控制

PCR實驗室設計的核心問題是如何避免汙染。在實際工作中，常見的有以下幾種汙染類型:擴增產物的汙染;天然基因組DNA的汙染;試劑的汙染以及標本間的汙染。因此要避免汙染，首先應是預防，而不是排除。

工作區域的嚴格劃分，各個實驗區域要有明顯的標記(如醒目的門牌或不同的地面顏色等)，以避免各個不同實驗區域設備物品、試劑等發生混淆。

合理的系統設置，合理的空調通風系統設置，儘量採用全送全排的空調系統;嚴格的氣流壓力控制，保證不同的實驗區內不同的壓力要求。

規範的操作，臨床基因擴增檢驗實驗室的技術人員必須進行上崗培訓，在實驗操作過程中，操作者必須戴手套，並經常更換。清潔工作及時、正確。實驗工作結束後，必須立即對本區進行清潔。

嚴格的管理:嚴格控制進出實驗室的人員。在各個實驗區域使用帶有明顯區別標誌的工作服(如不同顏色)，當工作人員離開時不得將本區的工作服帶至其它區域;儘量減少在實驗區內不必要的走動以減少交叉汙染的可能性。擴增產物分析區是最主要的擴增產物汙染來源，廢液不能在實驗室中傾倒，必須經消毒液浸泡消毒後在遠離實驗室的地方棄掉，用過的吸頭等一次性材料也應經消毒液浸泡消毒後統一處理，如焚燒等;

總之，實驗室建設是一個複雜的問題，這裡不討論人員的問題，實驗室人員的培養與沉澱，也需要一個過程，在建設的過程中要因地制宜，不要生搬硬套，結合自己的實際慢慢摸索出適合自己發展的建設思路。科學合理建設實驗室，更好的發揮實驗室的作用。

參考資料：

[1] 中華人民共和國住房和城鄉建設部，中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.GB50591-2010，潔淨室施工及驗收規範[S].北京:光明日報出版社，2010.

[2] 許鍾麟.空氣潔淨技術原理(3版)[M].北京:科學出版社，2004.

[3] 《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》(衛醫發[2002]10號).

[4] 劉書慶，謝逢潔.質量管理體系建立與實施維護[J]工業工程，2003.

[5] 2010年，衛生部辦公廳關於印發《醫療機構臨床基因擴增實驗室管理辦法》的通知.