眾所周知,蛋白質結構複雜,類別繁多,因此其水解物也有類似特徵。含蛋白質的原料在生物培養中被稱為有機氮源,可實際上,有機氮源不僅僅提供氮元素,也是生物生長和產物分泌調控所需要的,如維生素等。另外在有機氮源中,還往往含大量的碳源。
正因為有機氮源是培養基最重要的成分,而且結構複雜多樣,質量難控,因此在使用有機氮源時,很有必要對其原料來源、加工過程、關鍵指標等進行認真分析,甚至要到生產現場進行考察,否則一旦原料出現問題,對於一個複雜的發酵體系,根據無法迅速鎖定原因,容易造成巨大的經濟損失。因此質量穩定是供需雙方建立長久關係的基本保障。
本文將從概念、原料、分類、成分、加工方法和分析方法等全方位概述蛋白腖,是一篇值得收藏長期閱讀的文章。
另外也正是由於蛋白腖成分複雜,也使得在每個微生物發酵中使用蛋白腖成為可能,即使不為大規模應用,也可能在研發中使用蛋白腖以獲得關鍵影響因素或前體,為大幅度提高產量創造機會(該內容近期有文章介紹)。
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蛋白腖,英文名稱:peptone,是蛋白質分解產物,如將牛肉、酪蛋白、牛奶粉、白明膠、大豆蛋白、絲蛋白、血纖維蛋白等為原料,經不完全的水解工藝所得的產物。市售產品以淡黃至棕黃色粉劑為主。其分子量介於䏡和肽之間,約2000左右。
本概念最關鍵的用語:1是不完全水解,不完全是一個非定量的用語,所以,對於每家企業而言,蛋白質分解用酶及酶解的程度會不同,因此同樣是蛋白腖,對於需要精確控制的生物過程,則並不具有通用性,需要通過試驗驗證可用性。酶本身的催化作用也不具有精確性,酶的水解活力還會受到酶本身及催化環境的影響。
本概念另一個關鍵用語是蛋白質:不同物種,甚至相同物種的不同部位,蛋白質的種類不同,因此其產物也複雜多變。
蛋白質經酸、鹼或蛋白酶分解後也可形成蛋白腖。不同來源的蛋白質和不同的水解條件,其水解物中組成可千差萬別,所以腖往往是一個複雜的多肽混合物。除了胺基酸外,蛋白腖中也包括其他多種成分,因此能為生物培養提供C源、N源、生長因子等營養物質。
一般來說,用於蛋白腖生產的蛋白包括動物來源、植物來源和微生物來源的蛋白。目前人造肉的研究已經成為熱點,相信未來人造肉的副產物也可能成為蛋白腖的原料來源,該內容不在本文敘述的範圍。
主要包括:胰腖、肉腖、骨腖、蠶蛹蛋白腖、血液蛋白腖,魚蝦粉,牛奶粉等。下表4的數據可供參考。
知識擴展:豬骨為原料製備蛋白腖主要過程
1、原料:以豬頭骨、三大骨為主。將配好的原料置於鍋內,用40-50℃水衝洗一遍,然後加水,其比例為1:1.2。
2、高溫萃取:加熱加壓至4kgf/cm2,保壓平衡2h。
3、調節pH:取工業鹽酸將肉湯的pH調到5.2。
4、消化:將肉湯溫降至合適的溫度,然後加入消化酶進行消化。
5、濃縮:將消化好的肉湯,用雙層紗布過濾,然後將上清加熱濃縮。
6、乾燥:將濃縮好的稀膏狀物,乾燥,然後磨粉,分裝。
流程圖:新鮮骨頭→粗碎→熬煮→去渣、去油→酶解→高溫滅活→過濾→噴霧乾燥→成品→理化檢測→細菌培養。
以花生粕,大豆等作為原料生產的蛋白腖等是植物性蛋白腖。植物蛋白腖含糖量相對較高。
知識擴展:脫脂冷榨花生粕製備蛋白腖的過程:
準確稱取脫脂冷榨花生粕5g 溶解於250 mL 去離子水中,用鹽酸調pH 至2. 0,加入5% 的胃蛋白酶(以底物為基準,3 000 U/g)並於37 ℃攪拌條件下酶解200 min,定期監測其水解度變化;水解完成後,將水解液用NaOH 調節pH 至8. 0,加入2% 鹼性蛋白酶(以底物為基準,50 000 U/g),於50 ℃攪拌條件下酶解190 min,定期監測DH% ;水解全部完成後將酶解液置於沸水浴中10 min 滅酶。冷卻至室溫後於4 ℃,5 000×g 離心25 min,取上清液冷凍乾燥,即冷榨花生粕蛋白腖。
表3為冷榨花生粕蛋白腖的理化指標。
比如,酵母蛋白腖就屬於微生物蛋白腖。基本製備過程可參考前一篇文章『詳解酵母抽提物』。一般而言微生物菌體成分簡單,蛋白含量高,所以更適合大規模應用,細菌蛋白腖總氮一般會超過14. 5% 。
在使用任何一種原料之前,需要對原料的標準進行確認,這個過程需要將已經檢測的原料標準與使用效果建立關聯,然後從中篩選出關鍵影響指標。如果暫時無法確立關鍵影響指標,臨時可以用搖瓶試驗進行原料驗收,但是這一標準往往與原料生產商提供的標準難以兼容,篩選有機氮源關鍵影響因素的方法,我們將在後期結合前體的篩選發文章一併討論。
以下指標可供參考:
蛋白腖在微生物生長或產物合成中主要是作為提供氮源的營養基質,因此,含氮量是蛋白腖重要的質量評價指標。高質量細菌蛋白腖總氮要求達到14. 5% 以上,植物蛋白腖由於含糖量相對較高,其總氮應不低於8. 5%。總氮採取微量凱氏定氮法測定
氨基氮含量可反映出蛋白質的水解程度,分析氨基氮含量對蛋白腖質量評判非常重要。同一微生物在不同氨基氮含量的蛋白腖培養基上,其菌落大小和生長形態可能存在一定差異。作為試劑級蛋白腖,其質量標準要求其氨基氮≥2. 5%。氨基氮含量採取甲醛滴定法測定
植物蛋白腖含糖量通常高於動物蛋白,不同動物蛋白腖含糖量也存在差異,如酪蛋白腖含糖量為(0. 64±0. 22)%、雞羽毛蛋白腖為0. 76%、魚蛋白腖為1. 33%。由於植物蛋白腖含糖量相對較高,不適合於配製糖發酵培養基。
糖含量採取苯酚硫酸法
部分微生物在生長與發酵過程中可降低培養基pH,使亞硝酸鹽和蛋白質分解產生的胺類物質生成亞硝胺,因此,蛋白腖中不應含有亞硝酸鹽,否則,應用於食品時可能會影響安全。
亞硝酸鹽法採取氨基苯磺酸⁃α⁃萘胺試液測定。
磷元素是微生物進行生物大分子(如核酸和蛋白質)生物合成重要的營養基質,也是培養基重要的pH 緩衝物質。培養基中一般磷添加量為0. 005~0. 010 mol/L 較為適宜,磷含量過高對微生物生長不利,易造成富營養化,因此,應控制蛋白腖中磷含量。
磷含量採取比色法(測定波長820 nm)測定。
氯化鈉是蛋白腖在中和過程中產生的主要鹽類。當培養基中NaCl 濃度過高時,培養基滲透壓通常也較高,不利於微生物生長。因此,應控制蛋白腖生產過程中的NaCl 含量。
氯化鈉含量採取滴定法測定
蛋白腖灰分主要源自原料和生產工藝中使用的磷酸鹽、矽酸鹽、氯化鈉等無機鹽物質,灰分含量的高低與生產工藝和生產原料等有重要關係,如採取酸解法或鹼解法製備蛋白腖時,其灰分通常比較高,可達到20%以上。通常情況下,灰分過高時,需對蛋白腖進行脫鹽處理以降低灰分含量,蛋白腖酶法製備可有效解決灰分過高這一問題。作為生化試劑用蛋白腖通常要求灰分含量≤15. 0%。
灰分根據GB 5009. 4-2016 測定
生化試劑用蛋白腖水分含量應低於5%,工業級蛋白腖對水分含量沒有做具體要求。蛋白腖含水量過高時易吸潮、結聯成塊、顏色變深、變質以及易受到降解等,是一項關鍵控制指標,不僅影響產品外觀性狀,還影響微生物生長和代謝產物合成。一般情況下,蛋白腖標準品含水量為(3. 83±0. 13)%。
水分含量測定根據GB 5009. 3-2016 測定
多數發酵工程師已經意識到了:國內外普遍存在培養基質量差異和批間質量不穩定的問題,這些批間差異往往與氮源的批間差異有直接關係,而前面的指標一般無法與生產效果有直接的對映關係,這是因為對於發酵,有機氮源中起關鍵作用的往往是維生素和游離胺基酸等因素。目前我國培養基質量標準體系建設較為落後,培養基原材料的系統研究較少。下表可直接反映了不同蛋白腖中維生素含量的巨大差異。
通過蛋白腖的定義可知,蛋白腖是蛋白的不完全水解物,因此成分遠比20種胺基酸要複雜的多。但是微生物在吸收的有機氮源多數是游離胺基酸。因此游離胺基酸的比例和種類就成為蛋白腖的關鍵指標,也是質量的重要指標。
1、滿洋,陳舜勝,曲映紅《南極磷蝦副產物酶解蛋白腖工藝優化及實際應用》
2、肖懷秋,李玉珍,林親錄等《冷榨花生粕蛋白腖質量分析及其在枯草芽胞桿菌增殖中的應用》
3、姜莎,辛慧,莫日根等《超高效液相色譜-串聯質譜法測定蛋白腖中9 種B族維生素》
4、黃菊,楊君麗,曾吉偉《酶法水解牛骨蛋白製備蛋白腖生化試劑的工藝》
未完待續