發酵工程師最值得收藏的文章:蛋白腖詳解

2021-01-16 發酵人社區


       眾所周知,蛋白質結構複雜,類別繁多,因此其水解物也有類似特徵。含蛋白質的原料在生物培養中被稱為有機氮源,可實際上,有機氮源不僅僅提供氮元素,也是生物生長和產物分泌調控所需要的,如維生素等。另外在有機氮源中,還往往含大量的碳源。

        正因為有機氮源是培養基最重要的成分,而且結構複雜多樣,質量難控,因此在使用有機氮源時,很有必要對其原料來源、加工過程、關鍵指標等進行認真分析,甚至要到生產現場進行考察,否則一旦原料出現問題,對於一個複雜的發酵體系,根據無法迅速鎖定原因,容易造成巨大的經濟損失。因此質量穩定是供需雙方建立長久關係的基本保障。

        本文將從概念、原料、分類、成分、加工方法和分析方法等全方位概述蛋白腖,是一篇值得收藏長期閱讀的文章。

        另外也正是由於蛋白腖成分複雜,也使得在每個微生物發酵中使用蛋白腖成為可能,即使不為大規模應用,也可能在研發中使用蛋白腖以獲得關鍵影響因素或前體,為大幅度提高產量創造機會(該內容近期有文章介紹)。

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蛋白腖,英文名稱:peptone,是蛋白質分解產物,如將牛肉、酪蛋白、牛奶粉、白明膠、大豆蛋白、絲蛋白、血纖維蛋白等為原料,經不完全的水解工藝所得的產物。市售產品以淡黃至棕黃色粉劑為主。其分子量介於䏡和肽之間,約2000左右。

本概念最關鍵的用語:1是不完全水解,不完全是一個非定量的用語,所以,對於每家企業而言,蛋白質分解用酶及酶解的程度會不同,因此同樣是蛋白腖,對於需要精確控制的生物過程,則並不具有通用性,需要通過試驗驗證可用性。酶本身的催化作用也不具有精確性,酶的水解活力還會受到酶本身及催化環境的影響。

本概念另一個關鍵用語是蛋白質:不同物種,甚至相同物種的不同部位,蛋白質的種類不同,因此其產物也複雜多變。

蛋白質經酸、鹼或蛋白酶分解後也可形成蛋白腖。不同來源的蛋白質和不同的水解條件,其水解物中組成可千差萬別,所以腖往往是一個複雜的多肽混合物。除了胺基酸外,蛋白腖中也包括其他多種成分,因此能為生物培養提供C源、N源、生長因子等營養物質。

一般來說,用於蛋白腖生產的蛋白包括動物來源、植物來源和微生物來源的蛋白。目前人造肉的研究已經成為熱點,相信未來人造肉的副產物也可能成為蛋白腖的原料來源,該內容不在本文敘述的範圍。

主要包括:胰腖、肉腖、骨腖、蠶蛹蛋白腖、血液蛋白腖,魚蝦粉,牛奶粉等。下表4的數據可供參考。

知識擴展:豬骨為原料製備蛋白腖主要過程
1、原料:以豬頭骨、三大骨為主。將配好的原料置於鍋內,用40-50℃水衝洗一遍,然後加水,其比例為1:1.2。
2、高溫萃取:加熱加壓至4kgf/cm2,保壓平衡2h。
3、調節pH:取工業鹽酸將肉湯的pH調到5.2。
4、消化:將肉湯溫降至合適的溫度,然後加入消化酶進行消化。
5、濃縮:將消化好的肉湯,用雙層紗布過濾,然後將上清加熱濃縮。
6、乾燥:將濃縮好的稀膏狀物,乾燥,然後磨粉,分裝。

流程圖:新鮮骨頭→粗碎→熬煮→去渣、去油→酶解→高溫滅活→過濾→噴霧乾燥→成品→理化檢測→細菌培養。

以花生粕,大豆等作為原料生產的蛋白腖等是植物性蛋白腖。植物蛋白腖含糖量相對較高。

知識擴展:脫脂冷榨花生粕製備蛋白腖的過程:

準確稱取脫脂冷榨花生粕5g 溶解於250 mL 去離子水中,用鹽酸調pH 至2. 0,加入5% 的胃蛋白酶(以底物為基準,3 000 U/g)並於37 ℃攪拌條件下酶解200 min,定期監測其水解度變化;水解完成後,將水解液用NaOH 調節pH 至8. 0,加入2% 鹼性蛋白酶(以底物為基準,50 000 U/g),於50 ℃攪拌條件下酶解190 min,定期監測DH% ;水解全部完成後將酶解液置於沸水浴中10 min 滅酶。冷卻至室溫後於4 ℃,5 000×g 離心25 min,取上清液冷凍乾燥,即冷榨花生粕蛋白腖。

表3為冷榨花生粕蛋白腖的理化指標。

比如,酵母蛋白腖就屬於微生物蛋白腖。基本製備過程可參考前一篇文章『詳解酵母抽提物』。一般而言微生物菌體成分簡單,蛋白含量高,所以更適合大規模應用,細菌蛋白腖總氮一般會超過14. 5% 。

在使用任何一種原料之前,需要對原料的標準進行確認,這個過程需要將已經檢測的原料標準與使用效果建立關聯,然後從中篩選出關鍵影響指標。如果暫時無法確立關鍵影響指標,臨時可以用搖瓶試驗進行原料驗收,但是這一標準往往與原料生產商提供的標準難以兼容,篩選有機氮源關鍵影響因素的方法,我們將在後期結合前體的篩選發文章一併討論。

以下指標可供參考:

蛋白腖在微生物生長或產物合成中主要是作為提供氮源的營養基質,因此,含氮量是蛋白腖重要的質量評價指標。高質量細菌蛋白腖總氮要求達到14. 5% 以上,植物蛋白腖由於含糖量相對較高,其總氮應不低於8. 5%。總氮採取微量凱氏定氮法測定

氨基氮含量可反映出蛋白質的水解程度,分析氨基氮含量對蛋白腖質量評判非常重要。同一微生物在不同氨基氮含量的蛋白腖培養基上,其菌落大小和生長形態可能存在一定差異。作為試劑級蛋白腖,其質量標準要求其氨基氮≥2. 5%。氨基氮含量採取甲醛滴定法測定

植物蛋白腖含糖量通常高於動物蛋白,不同動物蛋白腖含糖量也存在差異,如酪蛋白腖含糖量為(0. 64±0. 22)%、雞羽毛蛋白腖為0. 76%、魚蛋白腖為1. 33%。由於植物蛋白腖含糖量相對較高,不適合於配製糖發酵培養基。

糖含量採取苯酚硫酸法

部分微生物在生長與發酵過程中可降低培養基pH,使亞硝酸鹽和蛋白質分解產生的胺類物質生成亞硝胺,因此,蛋白腖中不應含有亞硝酸鹽,否則,應用於食品時可能會影響安全。

亞硝酸鹽法採取氨基苯磺酸⁃α⁃萘胺試液測定。

磷元素是微生物進行生物大分子(如核酸和蛋白質)生物合成重要的營養基質,也是培養基重要的pH 緩衝物質。培養基中一般磷添加量為0. 005~0. 010 mol/L 較為適宜,磷含量過高對微生物生長不利,易造成富營養化,因此,應控制蛋白腖中磷含量。

磷含量採取比色法(測定波長820 nm)測定。

氯化鈉是蛋白腖在中和過程中產生的主要鹽類。當培養基中NaCl 濃度過高時,培養基滲透壓通常也較高,不利於微生物生長。因此,應控制蛋白腖生產過程中的NaCl 含量。

氯化鈉含量採取滴定法測定

蛋白腖灰分主要源自原料和生產工藝中使用的磷酸鹽、矽酸鹽、氯化鈉等無機鹽物質,灰分含量的高低與生產工藝和生產原料等有重要關係,如採取酸解法或鹼解法製備蛋白腖時,其灰分通常比較高,可達到20%以上。通常情況下,灰分過高時,需對蛋白腖進行脫鹽處理以降低灰分含量,蛋白腖酶法製備可有效解決灰分過高這一問題。作為生化試劑用蛋白腖通常要求灰分含量≤15. 0%。

灰分根據GB 5009. 4-2016 測定

生化試劑用蛋白腖水分含量應低於5%,工業級蛋白腖對水分含量沒有做具體要求。蛋白腖含水量過高時易吸潮、結聯成塊、顏色變深、變質以及易受到降解等,是一項關鍵控制指標,不僅影響產品外觀性狀,還影響微生物生長和代謝產物合成。一般情況下,蛋白腖標準品含水量為(3. 83±0. 13)%。

水分含量測定根據GB 5009. 3-2016 測定

多數發酵工程師已經意識到了:國內外普遍存在培養基質量差異和批間質量不穩定的問題,這些批間差異往往與氮源的批間差異有直接關係,而前面的指標一般無法與生產效果有直接的對映關係,這是因為對於發酵,有機氮源中起關鍵作用的往往是維生素和游離胺基酸等因素。目前我國培養基質量標準體系建設較為落後,培養基原材料的系統研究較少。下表可直接反映了不同蛋白腖中維生素含量的巨大差異。

通過蛋白腖的定義可知,蛋白腖是蛋白的不完全水解物,因此成分遠比20種胺基酸要複雜的多。但是微生物在吸收的有機氮源多數是游離胺基酸。因此游離胺基酸的比例和種類就成為蛋白腖的關鍵指標,也是質量的重要指標。

1、滿洋,陳舜勝,曲映紅《南極磷蝦副產物酶解蛋白腖工藝優化及實際應用》

2、肖懷秋,李玉珍,林親錄等《冷榨花生粕蛋白腖質量分析及其在枯草芽胞桿菌增殖中的應用》

3、姜莎,辛慧,莫日根等《超高效液相色譜-串聯質譜法測定蛋白腖中9 種B族維生素》

4、黃菊,楊君麗,曾吉偉《酶法水解牛骨蛋白製備蛋白腖生化試劑的工藝》

未完待續

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  • 微生物培養基中的蛋白腖有何作用?
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  • 如何利用蛋白腖提升抗體的產量和質量?
    保護作用:蛋白腖通過不同類型的營養緩衝液發揮保護作用,包括保護細胞免受培養基成分的毒性影響,並且可以提高培養物中的關鍵成分濃度。此外,蛋白腖也已證明能通過延緩細胞凋亡來延長培養基壽命。性能增強劑:蛋白腖能夠顯著增強培養基性能,包括加快細胞生長、提高特定產能。此外,蛋白腖也表現出了影響產品的質量屬性如聚糖和電荷變體分布的能力。
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