Ebio Reader TM 3700M飛行時間質譜系統鑑別大腸埃希菌和志賀菌應用

大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli）和志賀菌（Shigella Castellani）都是具有高度傳染性、危害嚴重的革蘭陰性腸道致病菌, 病人感染後的臨床表現相似，如發熱、水樣腹瀉、劇烈腹痛等，嚴重可致死亡。臨床上大腸埃希菌和志賀菌的正確鑑定對臨床治療非常關鍵，因為不同的菌株間有毒力和耐藥性的差異，感染不同的致病菌，需要採用不同的治療方案。

從全基因組角度上，大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli）和志賀菌（Shigella Castellani）的平均核苷酸一致率＞95% ，保守DNA＞69%，符合同一個種的定義，它們在菌落形態及生物學特性方面都非常相似，因此在臨床實驗室的常規工作中很容易被混淆，影響疾病的準確治療。即使是通過16S rRNA 測序也只能鑑定到志賀菌-大腸埃希菌，並不能將其準確區分，進一步的鑑定需要依賴生化反應及血清學試驗，但是這兩種鑑定手段的實驗步驟複雜、耗時很長，根本無法滿足臨床上對時效性的要求。

基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜( matrixassistedlaser desorption / ionization time of flight massspectrometry，MALDI-TOF MS) 是近年發展起來的一種新型軟電離質譜技術，具有快速、準確、操作簡便、高通量、低成本等優勢，已經被廣泛應用於微生物的分型鑑定。由於大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli）和志賀菌（Shigella Castellani）基因水平上同屬於一個種，特徵性質譜圖高度相似，如果僅僅使用目前常用的微生物分型算法進行資料庫檢索，仍然會有錯誤鑑定的情況存在。

我公司基於自主智慧財產權的Ebio Reader^TM 3700M飛行時間質譜系統平臺，開發出了一套功能強大的人工智慧算法，準確區分基因型相近的難辨菌的解決方案，如大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli）和志賀菌（Shigella Castellani），準確度達到95%以上。

我們利用Ebio Reader^TM 3700M 分別對福氏志賀菌(Sh.flexneri)、大腸埃希菌（E.coli）以及兩種菌株的混合菌進行質譜鑑定以及蛋白質譜圖比較分析。雷射頻率20 Hz，每個樣本進行200次雷射採集，採集相對分子質量 2000Da～15000Da的蛋白質圖譜，通過數據分析軟體對採集到的3個樣品圖譜進行比對分析。3種樣品均在 2691、3737、4869、5381、6255、7274、9067、9743、10300 m /z 處出現相似的特徵峰，其蛋白質譜圖極為相似（圖1），如果單純通過資料庫檢索的話，極大可能會造成錯誤鑑定。

 

圖1：大腸埃希菌、福氏志賀菌以及混合菌的質譜圖

之後，我們分別選取福氏志賀菌51例，大腸埃希菌56例，利用Ebio Reader^TM 3700M飛行時間質譜系統進行質譜分析，通過神經網絡軟體比對觀察兩組細菌蛋白峰的差異，並運用強大的人工智慧算法將採集到的譜圖數據建立分類模型，然後利用此模型進行了盲樣鑑定。結果可以將大腸埃希菌和福氏志賀菌完美地區分開，分離度分別達到99.5%和95.4%，混合菌的分類結果顯示大腸埃希菌和福氏志賀菌分別為76.2%和23.8%，也說明了此樣品為混合樣本，且有一定的定量效果（如下表）。

 

通過軟體的聚類分析功能，更加直觀地顯示我們建立的這套方案可以將大腸埃希菌和福氏志賀菌以及二者的混合菌有效的分離（圖2）。

 

圖2：大腸埃希菌、福氏志賀菌以及混合菌的聚類分析

在此MALDI-TOF微生物自動鑑定檢測系統中，公司使用了自主研發、具有深度學習分析功能的神經網絡人工智慧軟體。通過上述案例證明此套人工智慧算法可實現對大腸埃希菌和志賀菌的準確區分鑑定，彌補了質譜技術在鑑定親緣關係相近菌種能力的不足，達到了精準醫療的目的，對臨床診斷及治療方面具有重要意義。

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