作者:馬爽1 湯鳳珍2 杜利軍2 伍國達3 馮峰2 程璐2 馬翔4
單位:1.廣州市花都區婦幼保健院檢驗科;2.廣州市花都區人民醫院檢驗科;3.廣東省江門市中心醫院檢驗科;4.廣州市花都區人愛醫院檢驗科
隨著科技的進步,自動化微生物鑑定系統、MALDI-TOF MS基質輔助雷射解析電離飛行質譜儀鑑定在臨床微生物室的廣泛應用,極大的提高了對臨床微生物的鑑定能力。由於微生物的種、屬繁多,存在多樣性、複雜性,選擇的鑑定特徵可能難以代表全部被鑑定菌株,特別是少見菌、疑難菌、分類「未明確菌」。當「試驗組合」不是所鑑定菌屬、菌種「獨有的」特徵時,會出現不明確、不能鑑定、近緣菌株不能區分的結果,微生物自動化鑑定系統根據鑑定卡/盤中「固定的」生理生化特徵鑑定,不能追加鑑別試驗,也容易出現問題。此外,顯色培養基雖具有快速篩查目標菌的優勢,但對於類似色素的菌株還需要進一步鑑別。志賀菌屬、沙門菌屬、大腸埃希菌O157、霍亂弧菌等不能僅憑生化特徵鑑定,還需要血清學的確認。不同的菌屬在培養條件、菌落形態、色素、氣味以及染色性質、菌體形態、動力等不盡相同,甚至有「獨特性」。細菌的革蘭染色是自動化微生物儀鑑定的重要方向性試驗,如果革蘭陰性菌錯用革蘭陽性菌鑑定卡可能有鑑定結果,但得到的結果南轅北轍,反之亦然。
本文基於大量常規鑑定經驗,總結在使用自動化系統過程中,通過不同鑑定方法的互補,重視表型特徵的觀察,提高臨床微生物鑑定的質量和水平,為臨床提供準確的病原學結果。
任何微生物鑑定系統都有可鑑定菌種的範圍,實驗室人員要了解應用系統的鑑定菌譜。
通常全自動微生物鑑定系統能夠對大多數臨床常見菌株鑑定到種,但對少部分菌株只能鑑定到複合種、群,實驗室針對這種情況需要補充鑑別試驗才能鑑定到種水平,這關係到藥敏試驗的敏感性結果解釋。VITEK 2操作手冊[1]指出了一些菌屬、菌群的菌株需要進一步鑑別,以下舉例說明。
1. 奧斯陸莫拉菌生理生化鑑定:該菌在營養瓊脂及麥康凱平板上不生長,在血平板上生長緩慢,35℃孵育48h菌落細小,溼潤,凸起或者扁平,不溶血。為革蘭陰性球桿菌,散在或者成對排列,無動力。氧化酶陽性,過氧化氫酶陽性,葡萄糖O/F:不利用。
奧斯陸莫拉菌使用VITEK 2 Compact的GN卡鑑定為莫拉菌群(99%概率,極好的鑑定),用NH卡鑑定為卡他莫拉菌(91%概率,好的鑑定)。莫拉菌屬部分菌種生化鑑別特徵見表1,鑑別反應及結果圖示見圖1。
【鑑別要點】(1)使用GN卡鑑定為莫拉菌群,當臨床需要時要進一步鑑定到種,鑑別特徵見表1。(2)使用NH卡鑑定為卡他莫拉菌,鑑定概率91%,為好的鑑定。此卡以鑑定奈瑟菌屬和嗜血桿菌屬為主,不能鑑定莫拉菌屬,卡他莫拉菌現稱作卡他布蘭漢菌。根據細菌的菌落形態、菌體特徵,這個菌與卡他莫拉菌差別較大,並且,脫氧核糖核酸酶(DNA酶)陰性,可以排除卡他莫拉菌。因此,即使NH卡鑑定率高,也是個錯誤的鑑定。(3)根據丁酸酯酶陽性、DNA酶陰性可鑑定為奧斯陸莫拉菌。
2. 嗜水氣單胞菌鑑定:氣單胞菌屬細菌在血平板上β-溶血或不溶血。為革蘭陰性桿菌,有動力,發酵葡萄糖產酸或產酸產氣,氧化酶陽性。本實驗室對10株嗜水氣單胞菌用VITEK 2 compact鑑定,報告為嗜水/豚鼠氣單胞菌(極好的鑑定,98%),需進一步做鑑別試驗確認鑑定結果,鑑別試驗見表2,鑑別反應及結果圖示見圖2。
3. 鉛黃腸球菌鑑定(ATCC 700327):在血平板上35℃孵育48~72h的菌落黃色,α-溶血,為革蘭陽性球菌,過氧化氫酶陰性。肉湯培養物鏈狀排列典型,有動力。此菌經VITEK2 compact鑑定,94%概率,低解析度。因鶉雞腸球菌也有動力,生化特徵相似,二者鑑別試驗見表3,表型特徵圖示見圖3。
鉛黃腸球菌和鶉雞腸球菌均對萬古黴素天然低水平耐藥,而糞腸桿菌和屎腸球菌對萬古黴素是獲得性耐藥,這兩類腸球菌的鑑別對臨床治療有重要意義。
質譜儀比自動化鑑定系統可鑑定的微生物種類和數量有很大擴展,但仍然存在鑑定某些的菌屬/種、菌群的細菌時有差異[2],需要補充試驗進一步鑑別,以下舉例說明。
1. 陰溝腸桿菌陰溝亞種鑑定:陰溝腸桿菌陰溝亞種經某種質譜儀鑑定結果為:陰溝腸桿菌(置信度33.3%)/神戶腸桿菌(置信度33.3%)/阿氏腸桿菌(置信度33.3%),三者都是同一個屬的不同種菌,說明該菌的質譜特徵圖譜不典型,需要進一步鑑別。三種菌的鑑別試驗見表4,若VP試驗陽性,報告陰溝腸桿菌陰溝亞種。
2. 肺炎鏈球菌與緩症鏈球菌群鑑定:肺炎鏈球菌在血平板上α-溶血,典型菌落為「臍窩狀」,如果是產生莢膜多糖的菌株,可見菌落光滑、溼潤;少數菌株的菌落與緩症鏈球菌群菌株無法區別,鑑別特徵見表5,鑑別反應及結果圖示見圖4。
3. 奧斯陸莫拉菌質譜儀鑑定:奧斯陸莫拉菌用不同品牌質譜儀的鑑定結果不同,質譜儀品牌甲報告:侵蝕艾肯菌(置信度99.9%);質譜儀品牌乙報告:奧斯陸莫拉菌;莫拉菌的鑑別特徵見表1,鑑別反應及結果圖示見圖1。
【鑑別要點】根據過氧化氫酶(3%H2O2)試驗陽性,排除侵蝕艾肯菌。
通過同一菌株在不同鑑定系統上的比對,大多數菌株的鑑定結果是相符合的,但少數菌株有差異。這種情況會導致實驗室間、或者實驗室在使用不同的鑑定系統時結果不符合,因此,針對鑑定結果與表型特徵明顯不符、存疑的菌株,實驗室需要補充試驗加以鑑別[3, 4, 5, 6, 7],以下舉例說明。
1. 志賀菌屬鑑定:目前的質譜儀對志賀菌屬的菌株報告為大腸埃希菌,如果臨床要求檢查志賀菌屬,推薦用常規的克氏雙糖鐵、動力試驗的篩查。根據結果再用手工方法或微生物生化鑑定系統做鑑定,如果確定為志賀菌屬的菌株,再進一步做志賀菌血清學分型確認試驗。
使用VITEK 2 Compact上能夠鑑定志賀菌,但質譜儀鑑定為大腸埃希菌,會造成漏檢。志賀菌屬菌株在不同鑑定系統中的結果差異見表6。
【鑑別要點】 手工或者微生物生化鑑定系統均可明確鑑定志賀菌屬,但須經過血清學確認。應注意質譜儀對於來自糞便標本中檢出大腸埃希菌的甄別,避免漏檢志賀菌。
2. 大腸埃希菌O157:H7的鑑定:血清型O157:H7大腸埃希菌(E.coli O157)在麥康凱平板呈紅色菌落(發酵乳糖),山梨醇麥康凱平板呈無色半透明菌落,不發酵山梨醇是E.coli O157與普通E.coli的重要區別,其在顯色平板上呈酒紅色菌落。動力陽性(80%),O157:NM血清型無動力。在KIA上發酵葡萄糖和乳糖、產酸/產氣,氧化酶陰性,MUG(β-葡萄糖醛酸糖苷酶)和山梨醇均陰性。
E.coli O157:H7在VITEK 2 Compact上能夠明確鑑定,使用某品牌質譜儀鑑定為E.coli,造成漏檢。E.coli O157:H7在不同鑑定系統中的結果差異見表7,鑑別反應及結果圖示見圖5,血清凝集反應圖示見圖6。
【鑑別要點】 根據E.coli O157:H7山梨醇和MUG兩項試驗陰性,或使用E.coli O157顯示平板可以快速篩查出來,菌株還需要生化鑑定和血清學或乳膠凝集試驗確認。應注意質譜儀對於來自糞便標本中檢出的大腸埃希菌的甄別,避免E.coli O157漏檢。
該菌在血平板、巧克力平板上生長緩慢,菌落細小,35℃孵3天(空氣環境)見針尖樣菌落,孵育5天,菌落<1mm,不溶血。在鮑特菌平板上孵育4天的菌落>1mm、圓形、凸起、光滑,光照下的菌落水銀滴樣。為革蘭陰性球桿菌,菌體似細砂,著色深。氧化酶和過氧化氫酶陽性,葡萄糖O/F:不利用,尿素酶陰性,硝酸鹽還原酶陰性,無動力。與百日咳鮑特菌診斷血清凝集。VITEK 2 compact不能鑑定百日咳鮑特菌,VITEK MS質譜儀鑑定結果:百日咳鮑特菌(置信度50%)/支氣管膿毒鮑特菌(置信度50%);需要對菌株做進一步鑑別,鑑別反應及結果圖示見圖7。
【鑑別要點】(1)百日咳鮑特菌生長緩慢,菌落細小,不能在麥康凱平板上生長,菌體細小,尿素酶陰性,可用特異性血清學鑑定。(2)支氣管膿毒鮑特菌對營養要求不高,在麥康凱平板生長,菌體細長,尿素酶陽性,與百日咳鮑特菌有明顯區別。
4. 新洋蔥伯克霍爾德菌鑑定:新洋蔥伯克霍爾德菌在血平板上35℃孵育24h,菌落細小。延長孵育時間菌落增大,圓形、凸起、光滑、溼潤。革蘭陰性桿菌、氧化酶陽性、葡萄糖O/F:氧化型。洋蔥伯克霍爾德菌群種間的表型特徵非常相似,即使補充試驗鑑別,菌種的鑑定仍然困難,質譜儀有鑑別優勢。新洋蔥伯克霍爾德菌在VITEK 2 Compact鑑定結果:洋蔥伯克霍爾德菌群(好的鑑定,94%);VITEK MS質譜儀鑑定結果:新洋蔥伯克霍爾德菌(置信度99.9%)。如果需要進一步鑑定到種水平,鑑別特徵見表8。
顯色平板專為目標菌的快速篩選而研製,是根據微生物特定的酶水解底物顯色,且目標菌在此培養基上生長良好,顯色快、色素鮮豔而容易識別。雖然顯色平板中的抑菌劑會抑制「雜菌」的生長,但是,具有該種酶且能夠生長的「雜菌」,會產生類似的色素,因此,不能僅僅根據色素而未經鑑定就直接發出報告,在表型特徵不符合時,還需要進行鑑定確認,謹防誤報。
1. 在念珠菌顯色平板(科瑪嘉)上生長綠色菌落的菌株:白念珠菌(ATCC10231)、都柏林念珠菌(質譜儀鑑定:置信度99.9%)在科瑪嘉念珠菌顯色平板上均形成綠色菌落 ,並且在血清中都產生芽管,容易混淆。因此,對綠色分離菌株需要進一步通過生化試驗或自動化儀器鑑別。在念珠菌顯色平板上產生綠色色素的不同菌種見圖8。
2. 在頭孢磺啶-氯苯酚-新生黴素(CIN)顯色平板上生長紅色菌落的菌株:CIN平板是篩查腹瀉致病菌小腸結腸炎耶爾森菌(VITEK 2 Compact好的鑑定,98%)的顯色平板,菌落呈紅色。但可引起腹瀉的氣單胞菌屬的3個種在這種培養基上也生長良好,菌落也呈紅色,由於它們存在於糞便中,容易混淆,需要加以鑑別。在CIN平板上產生紅色菌落的不同菌種見圖9。
【鑑別要點】小腸結腸炎耶爾森菌氧化酶試驗陰性,氣單胞菌屬氧化酶試驗陽性。
3. 在無乳鏈球菌(科瑪嘉)顯色平板上生長紅色菌落的菌株:除無乳鏈球菌外,解沒食子酸鏈球菌巴斯德亞種(質譜儀鑑定:置信度99.9%)與表皮葡萄球菌(質譜儀鑑定:置信度99.9%)在無乳鏈球菌顯色平板上生長,也是紅色菌落。其中,表皮葡萄球菌對紅黴素耐藥,菌落小、生長慢。這兩種菌株都分離自圍產期孕婦陰道分泌物,因此,不能簡單地把紅色菌落作為無乳鏈球菌報告,需要進一步鑑別確認,誤報無乳鏈球菌會對孕婦造成過度治療。無乳鏈球菌過氧化氫酶陰性,CAMP試驗陽性,作為特徵性鑑定試驗。在無乳鏈球菌顯色平板上產生紅色菌落的其他菌種見圖10。
【鑑別要點】(1)解沒食子酸鏈球菌巴斯德亞種是鏈球菌屬的一個種,CAMP試驗陰性可排除。(2)表皮葡萄球菌菌體排列、過氧化氫酶陽性可鑑別。
4. 在沙門菌(科瑪嘉)顯色平板上生長紅色菌落的菌株:沙門菌產生辛酸酯酶,分解底物產生紅色菌落,但糞便中還有其他菌種的細菌生長也呈紅色菌落,容易與沙門菌屬混淆,需要進一步鑑別。在沙門菌顯色平板上產生紅色菌落的不同菌種見圖11。
【鑑別要點】(1)氣單胞菌屬與類志賀鄰單胞菌氧化酶試驗陽性可排除;(2)摩根摩根菌苯丙氨酸脫氨酶試驗陽性可排除;(3)大腸埃希菌與志賀菌按常規方法鑑別。
本文僅列舉了作者在日常工作中遇到的一些案例,當然,存在鑑定差異的菌株不僅限於此。當系統給出的鑑定結果為低解析度或低置信度、不能區分的結果或給出多個結果、或對於一些少見菌用不同系統鑑定出現結果不一致等情況時,特別是無菌部位來源的標本、侵襲性方法採集的標本、免疫抑制患者等因素,應根據微生物的形態學、生理生化特性做進一步鑑定到種或亞種水平[2]。為臨床報告正確的病原學結果,對臨床治療有重要意義。
參考文獻略
註:本文來源於《臨床實驗室》雜誌2020年第10期「感染性疾病」專題