臨床絲狀真菌鑑定是難點,VITEK MS來支招

2020-12-07 儀器信息網

當田中耕一因發現『生物大分子的軟電離技術』而獲得2002年諾貝爾化學獎時,他一定沒有預想到,短短十幾年時間,這一技術能夠在微生物領域帶來如此巨大的變革。

　　MALDI-TOF MS這一技術自應用於微生物以來，其技術的成熟度和商品化程度迅猛發展令人咂舌。今天當一位臨床微生物工作者說出「鑑定結果來自質譜」時，已經不再是帶有些許的懷疑，而是成竹在胸的自信。成本低廉、操作簡單、快速而準確已經使得質譜技術成為微生物發展中不可阻擋的一股趨勢。

　　即使在這樣的潮流下，也並非所有的事情都是那麼一帆風順的。

　　比如對於微生物中的絲狀真菌，應用於質譜鑑定並非一路坦途。

　　不論是產品研發還是臨床應用，絲狀真菌在譜上的鑑定似乎註定要經歷更多的時間和坎坷，而當下微生物工作者在這個問題上似乎仍然更依賴於形態學鑑定，縱使遇到難題時首先也是考慮測序的方法。

關鍵問題一

　　從原理上來看，絲狀真菌的鑑定和細菌並無不同，此處省略1000字並再次腦補MALDI-TOF MS的原理過程̷̷

　　然而必須要強調的是，對於微生物的質譜鑑定，一個足夠豐富、有組織性的資料庫才是真正重要的關鍵條件。這也是在某些資料庫中的一個顯著短板，即對於真菌，尤其是雙相真菌和絲狀真菌難以獲得一個令人滿意的結果，這些質譜系統要麼是鑑定出一堆不相關的低分辨結果;要麼由於分值太低而鑑定失敗。

　　需要注意!

　　對於鑑定失敗的情況，一方面可能是由於資料庫中確實不包含該菌種，另一方面可能資料庫中包含該菌種，但在臨床工作中分離出的臨床菌株因為和建庫菌株間的異質性(heterogeneity)而不能很好的匹配，導致沒有鑑定結果。

　　絲狀真菌質譜鑑定的複雜性正體現在此，由於絲狀真菌本身的蛋白成分相比細菌更加複雜，加之培養條件、菌絲體大小、產孢情況的不同，也會導致絲狀真菌的蛋白圖譜會發生較大的差異變化，這顯然給質譜的鑑定帶來了一定程度的挑戰。因為試圖通過少量菌株的圖譜來「演繹」所有菌株可能性的情況並不現實，這種蛋白表達上的「質」和「量」的變化是難以預測的。而可能的一個解決途徑則是儘可能收集不同來源的菌株和不同培養條件下獲得的圖譜，通過「歸納」的方法將所有蛋白特徵進行整理，以期覆蓋該菌種的普遍性特徵，並滿足臨床鑑定的需要。

黑麴黴在SDA平板上生長2天和8天獲取的圖譜

　　關鍵問題二

　　另一個問題是絲狀真菌的前處理：

　　和一般細菌以及酵母樣真菌不同，通過基質液甚至是甲酸處理並不能有效破壞其細胞壁並充分獲取其蛋白。這是因為絲狀真菌的細胞壁中包含一種叫幾丁質的物質，該物質同樣存在於昆蟲的甲殼中，它不能被普通的有機溶劑(乙醇、甲酸等)所溶解。這也是為什麼很多實驗室按照一般的提取流程，所獲得用於分析的蛋白波峰非常少，從而導致鑑定失敗。

　　2018年10月，VITEK MS獲得FDA臨床實驗驗證的菌種數量已經達到401種，而其中絲狀真菌達到了47種；成為目前唯一通過FDA認證的可用於絲狀真菌的MALDI-TOF MS系統!

　　其中包括了毛黴、雙相真菌、皮膚真菌、暗色真菌、麴黴及其他潛在的病原菌。

　　在外部臨床實驗中總共檢測了1519株絲狀真菌，達到了91%的正確鑑定率²，這顯然已經完全達到了臨床診斷的要求。

　　值得注意!

　　VITEK MS IVD資料庫中的絲狀真菌已經超過了100種，但這其中仍然有一部分因為臨床試驗中沒有分離到足夠的菌株而尚未獲得FDA的認證。

　　VITEK MS通過FDA批准的絲狀真菌種類：

　　Q&A

　　為什麼目前只有VITEK MS的絲狀真菌鑑定能夠通過FDA的嚴苛考評呢?

　　正如前文所述，一方面梅裡埃為VITEK MS的資料庫開發提供了強大的菌株庫，作為擁有全球最大的菌株貯藏機構之一，在絲狀真菌的建庫上選擇了多株有代表性的菌株，同時經過不同的培養條件、培養時間及不同的操作人員獲取圖譜並通過權重矩陣的算法實現對普遍性的覆蓋。

　　另一方面，專利性的絲狀真菌提取技術(U.S. Provisional Patent Application no. 62/209,116)能夠在保證生物安全的同時，實現高效率的蛋白提取，獲得高質量的蛋白圖譜。

　　2012年，VITEK MS成為史上第一臺獲得FDA認證的微生物質譜鑑定系統，從此質譜的臨床應用開啟了全新的時代。

　　而隨著絲狀真菌感染越來越受到臨床的關注，質譜鑑定的方法已經成為臨床工作中必不可少的選項，在這一領域中，VITEK MS再次走在了前列。

　　

VITEK MS 全自動快速微生物質譜檢測系統

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