卡邁舒生物今日推薦給您細胞的保存方法及培養要點

　　一、設施：

　　1實驗室房間.　　2.超淨工作檯.　　3冰箱：4℃冰箱和低溫冰箱。 4顯微鏡(倒置顯微鏡+攝像系統)。

　　5二氧化碳孵箱。　　6離心機。　　7恆溫水浴箱。　　　8深低溫保存設備：層析降溫儀，液氮裝置。

　　9抽濾裝置和水純化裝置。　　　　10角膜內皮分析儀。　　　　11計算機。

　　二、組織培養和保存：

　　(一)、組織培養的基本概念： 把體內的細胞、組織和器官放在類似體內的體外環境中，可使其存活、生長、繁殖或傳代。藉以觀察研究其生長發育、細胞形態和功能，從血分機研究某些疾病的發病機制。嚴格地說來，組織培養又可分細胞培養、組織培養和器官培養。

　　1.細胞培養(cell culture) 是將機體內的組織取出分散(機械或酶消化)成為單個細胞，使其在人工培養條件下保持生長、分裂繁殖、細胞的接觸性抑制(contactimhibition)以及細胞衰老過程等生命現象。在細胞培養中，細胞不再形成組織。

　　2.組織培養(tissue culture) 指組織在體外條件下維持生長，組織仍可分化並維持其結構和/或功能。需要說明的是，進行組織培養時，不論採用什麼方法和條件，被培養組織的主要成分仍然是細胞;細胞在生長過程中總有移動和其他變化，這將使得培養的組織難以長期維持其特有的結構和功能。培養時間越長，發牛變動的可能性就越大。結果，常使單一類型的細胞保存下來，最終也成了細胞培養。另外，所謂細胞並不意味著細胞彼此是獨立的，細胞之間仍然相互依存，呈現一定組織的特性。所以，組織培養和細胞培養並無嚴格區別，兩者在一定程度上可看作是同義語。

　　3.器官培養(organ culture) 指器官為原基、整個器官或器官的一部分，在體外條件下維持生長或分化並保持結構和/或功能。 原代培養或初代培養(Primary culture)，即從體內取出細胞或組織的第一次培養。傳代(passage)或再培養(reculture)，即把一瓶培養細胞全部或分成幾份接種人另一些培養器皿中。原代培養經首次傳代成功後即為細胞系(celllinne)。具有無限繁殖能力和能反覆進行傳代的細胞系，即為連續或無限細胞系(continuous cell line)，又稱為已建細胞系(estabilshed cell line)。體外(in vitro)培養是在體外進行的生物過程的實驗，現在常與組織培養一詞通用，與體內(in vivo)相對。

　　(二)、組織培養的基本條件： 在體外培養細胞必須能夠維持和模擬細胞在體內生存的良好環境和物質代謝過程，為此必須提供必需的營養、適宜的pH、嚴格的無菌條件、滲透壓、培養器皿、溫度和二氧化碳等條件。

　　1培養基： 目前廣泛使用的培養基是化學合成培養基：

　　其主要成分是胺基酸、維生素、碳水化合物、無機離子和一些其他輔助物質;

　　(1).胺基酸(amino acid) 胺基酸是組成蛋白質的基本單位。所有細胞都需要酪氨酸、組氨酸、賴氫酸、精氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸等12種胺基酸。它們都是細胞用以合成蛋白質的必需原料，不能由其他胺基酸或糖類轉化合成。除此之外，還需要穀氨醯胺。穀氨醯胺具有特殊的作用，能促進各種胺基酸進入細胞膜;它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的來源，還是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺甘和三磷酸腺苷的原料。

　　(2).維生素(vitamins) 是維持細胞生長的一種生物活性物質，它在細胞中大多形成酶的輔基或輔酶，對細胞代謝有重大影響。其中脂溶性維生素(A、D、E、K)常從血清中得到補充。水溶性維生素包括牛物素、葉酸、煙醯胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素和B12。維生素C也是不可缺少的，對具有合成膠原能力的細胞更為重要。

　　(3).無機離子(ion) 細胞的生長，除了需要鉀、鈉、鈣、鎂、氮和磷等基本元素以及碳酸氫鹽和磷酸氫鹽等以外，還需要鐵、銅、鋅等微量元素。這對調節細胞滲透壓、某些酶的活性以及溶液的酸鹼度都是必須的。

　　(4).碳水化合物(carbohydrate) 碳水化合物是細胞生命的能量來源，有的是合成蛋白質和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖和丙酮酸鈉等。

　　(5).激素和生長因子(hormone and growth factor) 。

　　(6).其他成分 在較為複雜的培養液中還包括核酸降解物(如嘌呤和嘧啶兩類)以及氧化還原劑(如穀胱甘肽)等。有的培養液還直接採用了三磷酸腺苷和輔酶A。

　　2、氣體和pH值： 氣體也是細胞生存的必需條件之一，所需氣體豐要是氧和二氧化碳。氧參與三羧酸循環，產生能量供給細胞生長、增殖和合成各種成分。 一些細胞在缺氧情況下，借糖酵解也可獲取能量，但多數細胞缺氧不能生存。在開放培養時，一般置細胞於95%空氣加5%二氧化碳的混合氣體環境中培養。 二氧化碳既是細胞代謝產物，也是細胞所需成分，它主要與維持培養基的pH有直接關係。動物細胞大多數需要輕微的鹼性條件，pH值約在7.2。7.4c在細胞生長過程中，隨細胞數量的增多和代謝活動的加強，二氧化碳不斷被釋放，培養液變酸，PH值發生變化。為了維持培養液pH值的恆定，通常加入NaHC03來調節。由於NaHCO3容易分解為二氧化碳，很不穩定，致使緩衝系統難以精確地控制。故這一緩衝系統適合密閉培養。HEPES結合碳酸氫鈉使用，可提供更有效的緩衝體系，主要是防止pH值迅速變動，但最大缺點是在開放培養或觀察時難以維持正常的pH值。

　　3、培養瓶和培養皿： 培養細胞的性質不同，所採用的培養器皿也不向。單層培養可採用塑料或玻璃瓶。半固體培養可採用膠原或瓊脂等凝膠，通常使用長方型的玻璃培養瓶，其優點是可以清洗、消毒和反覆使用，但仍有被汙染的可能性c國外已普遍採用系列化塑料製品，一次性使用後即棄去。其優點是方便、可靠，但成本較高，國內尚不能普遍應用。

　　4、溫度： 培養細胞的最適溫度相當於各種細胞或組織取材機體的正常溫度。人和哺乳動物細胞培養的最適溫度為35C—37C。偏離這一溫度，細胞正常的代謝和生長將會受到影響，甚至死亡。總的來說，培養細胞對低溫的耐力比高溫高。溫度不超過39C時，細胞代謝強度與溫度成正比;細胞培養置於39C—40C環境中1h，即受到一定損傷，但仍能恢復;當溫度達43C以上時，許多細胞將死亡。 當溫度下降到30Y—20C時，細胞代謝降低，因而與培養基之間物質交換減少。 首先看到的是細胞形態學的改變以及細胞從基質上脫落下來。當培養物恢復到初始的培 養溫度時，它們原有的形態和代謝也隨之恢復到原有水平。

　　(三)、組織細胞的保存： 為了防止因汙染或技術原因使長期培養功虧一簣，考慮到培養細胞因傳代而遲早會出現變異，有時因寄贈、交換和購買，培養細胞從一個實驗室轉運到另一個實驗室，最佳的策略是進行低溫保存。這對於維持一些特殊細胞株的遺傳特性極為重要。現簡要介紹深低溫保存法(-70℃—-196C)的特點。

　　細胞深低溫保存的基本原理是：在-79C以下時，細胞內的酶活性均己停止，即代謝處於完全停止狀態，故可以長期保存。細胞低溫保存的關鍵，在於通過0C-20C階段的處理過程。在此溫度範圍內，水晶呈針狀，極易招致細胞的嚴重損傷。用電鏡觀察，可見細胞的核膜上有大量針尖樣小孔。牛化研究發現，在此溫度範圍內，鉀離子和鈉離子集聚在細胞兩側，具有細胞毒性。因此，為了避免0C——20C冰晶的形成和細胞膜兩側離子平衡的破壞，需要加保護劑。目前常用的保護劑有甘油和二甲基亞礬(DM50)，它們可降低冰點，在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水分在凍結前透出細胞外。貯存在-130C以下低溫中能減少冰晶形成，DMSO和甘油對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞，使用濃度範圍為5%—15%，一般常用10%o 為了保持細胞最高的存活率，一般採用慢凍快融的策略。標準冷凍速度以13℃/分的速度下降，當溫度達—30C時，下降速率可增至15C—30C/分，到達-100C時則可迅速浸入—1%℃的液氮中。要適當掌握下降速度，過快將減少細胞水分透出，太慢則易促進冰晶形成。 復甦細胞時，可將細胞取出後立即投入37C-40C水溶化凍融，迅速通過細胞最易受損的-50℃。此時細胞仍能生長，活力不受任何影響。

　　(四)、組織培養的應用： 傳代細胞系可用來研究細胞的功能，如分泌的產物或與其他類型細胞的交互作用。然而，應該注意到體外的培養狀態不同於活體的細胞環境c所以，在體外觀察到的功能有時僅反映了該細胞類型的內在能力，而不是其在正常體內的能力; 當懷疑某種疾病是代謝因素引起時，可用來自相關組織的細胞進行培養，以鑑別細胞在生理學上的內在缺陷。還可研究與活體病理因素相近的某些環境或因素對正常細胞功能的影響。這些因素包括在正常活體內自然發生的動態改變，如激素水平的變化。另外，組織培養還用以測定外源性物質的毒性。 細胞培養在病毒感染的診斷和研究方面起著重要的作用。大量細胞培養可產生製造疫苗所需的病毒抗原和幹擾素等。角膜細胞已用於單疤病毒感染機制的研究。角膜上皮和內皮的培養細胞移植是目前正在研究的課題。

　　(五)、培養和保存用液：

　　1.平衡鹽溶液(balanced salt solution,BSS) 主要由無機鹽和葡萄糖組成。無機鹽離子不僅是細胞生命所需成分，而且在維持滲透壓、緩衝和調節溶液的酸鹼度方面也起著重要的作用。少量的酚紅溶液作酸鹼度變化的指示劑，溶液變酸時呈黃色;變鹼時呈紫紅色;中性時呈桃紅色。藉此很容易觀察到培養液pH的變化。 Hsnks液和Earle液可作為較為完善的溶液的代表。它們之間的主要區別是緩衝系統不同。Hanks液緩衝能力較弱，在普通空氣條件下可達到平衡;Earle液含高濃度的NaHC03，緩衝能力較強，需用5%的二氧化碳平衡，辦即在二氧化碳孵箱中才能達到平衡。大多數培養基以Earle液做為基礎液。 由Dulbecco和Vogt製成的磷酸緩衝液(phosphate balanced solution PBS)，尤其是除去鈣和鎂的溶液，稱為PBS(-)，常用於細胞的洗滌以及作為胰蛋白酶和EDTA的溶劑。它不含NaHCO3，便於高壓滅菌。此外，它還用於製備L—穀氨醯胺及抗菌素等培養液的附加溶液。

　　2.合成培養基 合成培養基是根據天然培養基的成分，用化學物質模擬合成的，它有一定的配方，是一種理想的培養基。目前合成培養基多達10多餘種，有的培養基仍在不斷進行改良。對於培養基的選擇，則要根據條件和習慣，難以強求「律。到目前為止，國外所選用的用於角膜保存的培養基多為TC-199和低限量基礎培養基(mimi-mum essential medium, MEM)。

　　3.保存液的添加成分：

　　(1)葡聚糖(dextran)：又名右旋糖酐。Sachs(1957)首次將葡聚糖加入眼球保存液來防止角膜基質層發生過度水腫。以後，McCarey和Kaufman(1974)證實角膜在添加葡聚糖的保存液中可維持功能和超微結構的完整。但使用該保存液保存4天後，角膜平均厚度從0.65mm增加到0.75mm，從而妨礙了常規的內皮顯微鏡檢查。

　　(2)PH調整劑：早期，國外商業化的短期保存液，PH值很穩定。這並不奇怪，因為在組織保存液中含有一定量的碳酸氫鈉。但這種穩定需要用二氧化碳氣體來平衡。使用密封的保存瓶則很難維持恆定的PH值。所以，在組織培養系統中加入合成的pH穩定劑非常重要。在角膜長期灌洗實驗中發現，經乙基哌嗪乙硫磺酸(N-2-hydrox-yethylpiperazine-N-ethane-sulphonic acid,HEPES)具有很好的穩定pH的性能。目前，將按15—20mM/L加入保存液，可使PH值穩定在7.3。在HEPES存在的情況下，不必強調使用PH指示劑。

　　(3)2—琉基乙醇(2—mercaptoethanol，2—ME)：2—ME對細胞的生長具有重要作用。有人認為它相當於胎牛血清的可透析組分，可直接刺激細胞生長。其活性部分是硫氫基，能使血清中含硫的化合物還原成谷骯甘肽，誘導細胞增殖，這是一種非特異的激活作用，並能同時避免過氧化物對培養細胞的損害。另一個重要作用是促進對分裂原的反應和DNA合成。常配製成0.1mol/l的貯存液，使用時每升培養液加0.5ml。

　　(4)抗生素：屍眼的表面極易汙染，隨著時間的延長，細菌繁殖迅速增加。故應採取必要的措施來保持組織的無菌性。用力衝洗可機械性地去除大多數微生物。保存液本身也應提供一個無菌的環境。青黴素在高濃度時具有廣語的殺菌作用，但維持時間比較短。對供體眼細菌汙染情況的研究結果表明：慶大黴素和多粘菌素(polymyxin)在對抗致病菌(綠膿桿菌和葡萄球菌)方面最為有效。在短期保存液中，慶大黴素(100微克、mL)可去除85%的供眼汙染。因為存在有耐慶大黴素菌株，而多粘菌素對它們有100%的對抗作用，所以兩者合用效果可能較佳。

　　(5)血清：血清是一般培養基所必需含有的成分。

　　血清的作用是：

　　①營養：血清中含有各種生長因子，可刺激細胞生長。

　　②解毒：包括抑制抗菌素的毒性。血清中含有結合毒性物質的因子，可解除脂肪酸、重金屬和蛋白質的毒性。

　　③中和胰蛋白酶的活性。

　　④提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷。

　　⑤提供一些酶、維生素、微量元素和激素等。

　　對血清的成分和作用的研究雖有很大進展，但仍存在一些問題。

　　主要是：

　　第一、血清的成份可能有幾百種之多，目前對其準確的成份、含量及其作用機制仍不清楚，尤其是對其中一些多肽類生長因子、激素和脂類等尚未充分認識，這給研究工作帶來許多困難;第二，血清都是批量生產，各批量之間差異很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保證每批血清的相似性極為困難，從而使實驗的標準化和連續性受到限制;

　　第三，不能排除血清中含有易變物質，這被認為是「瓶中惡化」的原因之一。血清又可能成為病毒和支原體汙染的來源之一。因此，尋找血清替代物已成為培養工作的一項任務。但目前更多地還是使用無血清培養基培養細胞。