轉移性腎細胞癌(RCC)長期以來被認為是一種「免疫性惡性腫瘤」，對不同的免疫療法敏感。免疫檢查點阻斷療法(ICB)的發展，使腎細胞癌(RCC)的臨床預後發生了革命性的變化。雖然如此，但治療響應的持續時間以及預測的改善仍舊沒有滿足醫療需求。雖然人們已經認識到抗生素(ATBs)會降低ICB在各種惡性腫瘤中的臨床活性，但對於不同的腸道非致病菌(共生菌)對ICB在腎細胞癌中的療效的直接影響卻知之甚少。
近日，來自法國科學家的一項發表在《Eur Urol (歐洲泌尿學雜誌)》期刊的一篇題為「Gut Bacteria Composition Drives Primary Resistance to Cancer
Immunotherapy in Renal Cell Carcinoma Patients」 研究發現：微生物群的組成受TKI和ATB的影響，並影響免疫治療的成功， 未來研究人員表示在開始治療前對糞便的分析可能可以指導臨床醫生用藥，以防止腎細胞癌患者對免疫治療的原發性耐藥。
簡稱/名詞介紹：
ORR：客觀緩解率，指腫瘤縮小達到一定量並且保持一定時間的病人的比例，也就是在任何時候完全緩解和/或部分緩解的患者數量。
PFS：無進展生存期，指從隨機分組開始到第一次腫瘤進展或死亡時間。
BOR：本文中，研究者評估的從nivolumab開始治療之日到治療結束的最佳腫瘤反應(完全緩解、部分緩解、疾病穩定或疾病進展)。
文章中使用RECIST療效評價標準1.1評估腫瘤反應
完全緩解【complete response，CR】：除結節性疾病外，所有目標病灶完全消失或所有目標結節須縮小至正常大小(短軸<10mm)
部分緩解【partial response,PR】：所有可測量目標病灶的直徑總和低於基線≥30%。目標結節總和使用短徑，而所有其它目標病灶的總和使用最長直徑。
疾病進展【progressive disease,PD】：可測量目標病灶的直徑總和增大≥20%超過觀察到的最小總和，如治療期間未觀察到總和降低，則定義為超過基線。
疾病穩定【stable disease,SD】：介於PR和PD之間。
摘要
文章的主要目的是評估在晚期腎細胞癌患者中，其腸道菌群組成對ICB療效的預測價值。研究人員收集了69例晚期腎細胞癌患者的糞便樣本和2994例健康志願者的糞便樣本。同時，研究人員還進行了臨床前研究，將對ICB具有抗性的腎細胞癌患者糞便微生物移植到荷瘤小鼠上，以此證明了腸道細菌組成與ICB臨床結果之間的因果關係。
研究人員還評估了在開始nivolumab治療前使用TKl對微生物群組成的影響。通過WGS-MG測序分析識別其微生物群組成。研究發現，近期抗生素使用可改變腸道菌群組成，並降低患者的客觀緩解率，促進了不同優勢物種類群的形成，如Clostridium hathewayi菌在腎細胞癌患者的糞便中較為富集。
還有一個重要的點，就是在接受nivolumab藥物前服用酪氨酸激酶抑制劑（TKI）能夠改變腸道菌群的組成。最後，研究人員表示微生物群的組成受TKI和ATB的影響，並影響免疫治療的成功。未來的研究將有助於提高這些特定細菌的作用，以及它們作為新的生物標誌物的潛力。
實驗設計
受試者納入標準：
對IV期腎細胞癌患者和疾病進展的患者每2周注射3mg/kg的nivolumab(納武單抗)，直到疾病進展或在NIVOREN
GETUG-AFU 26第二階段試驗中出現無法忍受的毒性為止。
細節：
第一年在基線和每8-12周進行一次CT掃描，然後每12-15周進行一次CT掃描直到疾病進展。根據國際人體微生物組標準指南(SOP_03_V1) 進行糞便樣本收集，在第一次注射nivolumab前(T0,<1mo)；第二次(T4,4wk)；第四次(T8,8wk)；第12次(T24,24wk)
宏基因組學和統計學分析：
從糞便標本中提取總DNA，並按照MetaGene Polis(INRA)工作流程使用IonProton技術進行測序。從豐度矩陣開始，只考慮在所有樣本中至少有20%存在的分類群，然後對原始數據進行歸一化和標準化。監督偏最小二程判別分析(PLS-DA)和隨後的變量對模型的重要性圖(VIP)找出與BOR相關的組中的差異物種。雙尾Mann-Whitney U和Kruskal-Wallis檢驗分別評估成對比較和多重比較的意義，p<0.05。計算用於網絡相關分析的Pearson矩陣。所有的p值都經過FDR矯正。
主要結果
1. ATBs影響了ICBs對腎細胞癌患者的臨床療效，並改變了腸道菌群的β多樣性和組成
ATB：抗生素；noATB：未使用抗生素；NR：無腫瘤反應；PR：部分緩解；PD：疾病進展；
PFS：無進展生存期；R：有腫瘤反應；SD：疾病穩定；ORR：客觀緩解率
(B).使用和不使用抗生素腎細胞癌患者人數佔總患者人數的比例以及不同RECIST療效結果佔使用或不使用抗生素腎細胞癌患者人數的比例。ATB組11例，在抗PD-1阻斷後2個月內服用抗生素；noATB組58例，未服用抗生素。接受ATBs治療的患者的ORR低於未接受ATBs治療的患者（9%
vs 28%, p < 0.03，p值採用雙尾卡方檢驗）
(C). 基於PCoA分析的預處理樣品糞便微生物群組成標準化和歸一化數據的β多樣性排序圖。95%置信度。ANOSIM指標通過999次置換來評估ATB組和noATB組之間的差異。ATB個體與noATB個體的從糞便中分離出的細菌種類有顯著差異。
(D).
Lefse圖，基於LDA得分為每個組識別出差異物種。在這些差異物種中，如Eubacterium rectale菌在noATB糞便中富集，而其他細菌類群，如Erysipelotrichaceae bacterium_2_2_44A和Clostridium hathewayi在ATB糞便中富集。
2. 在noATB隊列中，腸道菌群組成可以預測ICBs的臨床結果。
利用糞便中的微生物組成的Alpha和Beta多樣性結果可以對腎細胞癌患者人群中的R和NR個體進行分層，並可用於預測PFS>
12個月的患者。
mAb：單克隆抗體；MGS：metagenomic species；SEM：標準誤
(A).對noATB基線樣本(n=58)中的糞便微生物使用鳥槍法測序，圖中展示了PFS<12個月和PFS>12個月的所有癌症患者的基因豐富度和MGS計數。ICBS開始後12個月，豐富度計數(GC)或MGS水平與以無疾病進展為標準的臨床反應相關。
(B). noATB預處理樣本的PCoA分析(使用細菌流行率>=20%的閾值)的β多樣性排序圖。95%置信度。ANOSIM和PERMANOVA指標使用999次置換，評估R（完全緩解或部分緩解或病變穩定>6個月）和NR（死亡或疾病進展或病變穩定<6個月）之間的差異。兩組間有明顯的分離。
(C).使用偏最小判別分析的變量對模型的重要性圖，按重要程度由大到小描述了35個組間差異物種。箭頭突出重要物種。條形填充顏色表示物種平均相對豐度最高的隊列，條形框顏色表示物種平均相對豐度最低的隊列。條形的寬度表示FR的高低。*表示Mann-Whitney
U檢驗的顯著性。Akkermansia muciniphila, Bacteroides
salyersiae,和 Eubacterium siraeum菌種比例過高。
(D).被選中的Akkermansiamuciniphila和Bacteroides salyersiae菌種的相對豐度和流行率條形圖。在腎細胞癌患者糞便中這兩種菌的流行率和相對豐度在R和NR隊列中都較高。相對豐度的p值由雙尾Mann-Whitney U檢驗得到，流行率的p值由卡方檢驗得出。
3.在腎細胞癌患者中，在使用nivolumab前先使用TKI和ATB藥物與腸道菌群組成改變密切相關。在69個RCC隊列中，R和NR的細菌比較分析，彌補了用NR-FMT在小鼠中觀察到的反應性的不足，建立了糞便中有利的細菌組成與臨床結果之間的因果關係。
CICB：聯合ICB治療；D0：隨機日期；Dx：最後一次IVIS測量；
(A). 在無特定病原體(SPF)的BALB/c小鼠體內注射ATB3天後進行糞便微生物移植(FMT)。2周後，原位接種螢光素酶工程腎癌(Luc+RencA)，從第7天開始每4天腹腔接種抗PD-1+抗CTLA-4單抗(CICB)或同型對照單抗(Ctrl)。此外，在第4天，每隔3天給接受CICB的受體小鼠口服Akkermansia muciniphila菌(Am)、Bacteroides salyersiae 菌(Bs)細菌B.xylanosolvens(Bx)或應答者患者(R)的糞便。
(B). 15份FMT供體糞便的比例. (人類有腫瘤反應者[HR]和人類無腫瘤反應者[HNR])在BALB/c小鼠(小鼠有腫瘤反應者[MR]和小鼠無腫瘤反應者[MNR])。觀察到患者的反應和小鼠受體對ICBS的反應之間有27%的一致性：只使用了4份高於15FMT的糞便樣本。
(C)(E).使用螢光素酶活性的生物發光成像監測ATB治療小鼠在FMT後的Renca進展。在每個ICB周期前口服具有免疫刺激作用的Am或Bs或R-FMT來補償NR-FMT(不含Am或Bs菌)，恢復了對治療的敏感度(犧牲時的腎臟重量)且螢光亮度降低。
(C)(D).使用腫瘤重量的生物發光成像監測ATB治療小鼠在FMT後的Renca進展。在每個ICB周期前口服具有免疫刺激作用的Am或Bs或R-FMT來補償NR-FMT(不含Am或Bs菌)，恢復了對治療的敏感度(犧牲時的腎臟重量)。
4. TKIs誘導腸道菌群改變。TKIs誘導了顯著的和典型的微生物群落改變，包括免疫刺激共生物種，可以利用這些共生物種來提高腎細胞癌患者ICBS的療效。[if !vml]
(A).接受TKI一線治療的患者與對照成人糞便菌群的差異。按LDA分值排序的組間差異物種。觀察到在TKI一線治療組中Akkermansia muciniphila和Alistipes senegalensis富集。
(B).對接受TKI治療(阿西替尼、舒尼替尼和卡博替尼)的BALB/c小鼠進行分析，利用偏最小二乘判別分析，差異物種按重要性從大到小排序。在BALB/c小鼠中，隨著時間的推移，所有三種TKI都顯著地誘導了菌群的α和β多樣性的變化。
箭頭表示相關的細菌種類。
柱狀條形圖分別描述了TKI治療組中最具判別意義的兩個菌種的相對豐度和流行率，即Akkermansia muciniphila和Alistipes senegalensis. 其中，觀察到在人類和小鼠身上，Sunitinib和Cabozantinib有效的刺激了Alistipes senegalensis的豐度增長。對於三種不同的TKI(axitinib(阿西替尼)、sunitinib(舒尼替尼)和Cabozantinib(卡博替尼))，使用Mann-Whitney U檢驗來評估統計學差異. (*p<0.05，**p<0.01，*p<0.001)
結論
通過應用不同的生物信息學和組間差異分析手段(LEfSe, PLS-DA, VIP, and networks)，研究人員確定了一組與原發耐藥相關的物種（厚壁菌門，梭菌科，Clostridium clostridioforme種和Clostridium hathewayi種），並且由於使用ATB和癌症轉移的狀況。這些物種變得豐富。據以往的一些研究報告，Clostridium hathewayi菌種是與結腸癌診斷相關的致病因子的一部分，並且可以減輕小鼠的抗原特異性T細胞反應。
研究人員還發現了一些與預後良好和腸道穩態狀態相關的共生物種，它們分別屬於優桿菌科(Eubacterium
rectale和Eubacterium siraeum種)，毛螺菌科(Dorea longicatena種)，Verrucomicrobioaceae科(Akkermansia muciniphila種)，而且都屬於擬桿菌目。
結果表示微生物群的組成受TKIs和ATBs的影響，並影響免疫治療的成功。ATB顯著影響微生物群的β多樣性，導致如前所述的優桿菌科家族成員(如Eubacterium rectale)的優勢不突出，而有利於致病菌種(Erysipelotrichaceae bacterium_2_2_44A和Clostridium hathewayi)。這種微生物群的改變與ICB治療期間ORR的降低有關(ATB組73%的原發耐藥，noATB 33%，p<0.03)。在使用nivolumab之前使用TKI也可導致腸道菌群組成的變化，可能抑制ICB的療效。該研究的局限性在於，比如研究的結論依賴於69名腎細胞癌患者的單一隊列，其中只有11名患者服用ATBs和二線治療，並受到許多混雜因素(既往治療、發病和其他因素，如血紅蛋白)的幹擾。
展望
研究人員表示在開始治療前對糞便的分析可能可以指導臨床醫生用藥，以防止腎細胞癌患者對免疫治療的原發性耐藥。而更好地了解腸道菌群組成與局部、全身和腫瘤免疫系統之間的機制聯繫，將有助於為腎細胞癌患者的腸道菌群失調設計最佳的補充治療方案。