作者:李映荷1,2，孟祥辰1，閻鵬光1，楊紅1，李驥1，錢家鳴1，李景南1,2
單位:1 北京協和醫院消化內科 2 中國醫學科學院腸道微生態與臨床轉化研究重點實驗室
通信作者:李景南 文章來源:協和醫學雜誌,2019,10(3):216-222.基金項目:國家自然科學基金(81770559);中國醫學科學院醫學與健康科技創新工程(2016-12M-3-001)
炎性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一種慢性非特異性腸道炎症性病變，分型包括潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)，克羅恩病(Crohn＇s disease, CD)以及未定型IBD。UC在中國IBD患者中最常見，其發病機制被認為是在遺傳易感者中，異常環境因素驅動導致的黏膜免疫應答紊亂和黏膜屏障功能異常。
腸道菌群是一類與IBD密切相關的環境因素。大量動物實驗和臨床試驗表明，腸道菌群在UC的發生、發展中起重要作用。與非IBD人群相比，UC患者的腸道菌群生物多樣性減少，菌群組成存在顯著差異，並隨病變程度的不同而發生顯著變化。
有研究發現，藥物治療會改變UC患者的腸道菌群組成];而相同治療方案對具有不同腸道菌群患者的療效也不盡相同。分析評估腸道菌群可能會成為預測藥物療效的潛在方法。目前關於糖皮質激素(glucocorticoid, GC)治療與中重度UC患者腸道菌群關係的研究較少，兩者之間相互影響的機制尚不明確。
本研究採用16S rRNA擴增子測序技術，對UC患者的糞便菌群進行測序和分析，探討中重度UC患者在GC暴露與否的情況下，腸道菌群是否存在差別，並比較靜脈激素治療早期療效不同患者間的腸道菌群差異。
1資料與方法
1.1 研究對象及病情評估
回顧性分析2016年11月1日至2018年6月30日間在北京協和醫院消化內科門診就診或住院治療的UC患者。
納入標準:
(1) 符合《炎症性腸病診斷與治療的共識意見 (2018年，北京)》中UC的診斷標準;
(2) 在北京協和醫院消化內科規律隨診(每年至少隨診3次，包括門診和住院);
(3) 採集糞便樣本時病情為中重度活動期, 即Mayo評分≥6分。
排除標準:
(1)有結直腸手術史;
(2)採集糞便樣本前兩周內使用過抗生素;
(3)合併其他慢性胃腸道疾病，如胃腸道腫瘤、胃十二指腸潰瘍、乳糜瀉、腸易激症候群等;
(4)糞便真菌、細菌培養或難辨梭菌毒素檢測陽性。
採用Mayo評分(包括患者採集糞便樣本時的大便頻率、便血情況、內鏡發現和醫師整體評價4個方面)評估疾病活動程度, 所有評分均由同一醫師盲評完成。根據蒙特婁分型，腸道病變範圍分直腸型(E1)，左半結腸型(E2)和全結腸型(E3)。
本研究通過北京協和醫院倫理委員會審核(倫理號JS-1488)，所有患者籤署知情同意書。
1.2 分組
根據採集糞便時患者的激素暴露情況，將入選患者分為激素組(採樣時正在接受GC治療)和無激素組(採樣時未使用GC)。進一步觀察無激素組患者入院後接受足量靜脈激素(即甲基潑尼松龍46~60 mg/d或琥珀醯氫化可的松300~400 mg/d)治療的情況，根據治療3d後排便頻率、血便量及血清炎症指標是否改善，將患者分為治療有效組和治療無效組:治療3 d後排便次數＞8次/d，或排便次數3~8次/d且C反應蛋白＞45 mg/L，為治療無效;排便次數≤3次/d，血便較前減少且到第7d時基本無肉眼血便，臨床症狀改善，為治療有效。
1.3 糞便樣本採集
於腸鏡檢查前1~2 d內、腸道準備前收集糞便樣本。糞便樣本儲存於糞便採集管中(德國SARSTEDT公司，貨號734311)，嚴格按照產品說明書操作，每管採集3~8 ml糞便樣本，收集後2 h內送至-80 ℃冰箱保存。
1.4 DNA提取、擴增、測序及分析
採用糞樣基因組提取試劑盒 (E.Z.N.A.TM stool DNA isolation Kit，Omega Bio-Tek公司，美國)提取糞便DNA，使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取到的DNA純度和質量。細菌16SrRNA基因的V3-4高可變區擴增引物如下:通用引物338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTA AT)。引物5'端連接一段長度為10個鹼基的接頭序列，用於後續高通量測序。擴增產物通過膠回收試劑盒 (QIAquick Gel Extraction Kit，QIAGEN公司, 德國)提純，並採用實時螢光定量PCR分析。基因高通量測序由北京Allwegene公司通過Miseq平臺完成，擴增後的圖像分析、鹼基識別及誤差估計採用Illumina Analysis Pipeline(版本2.6)完成，剔除原始數據中DNA長度小於200 bp、質量評分 ≤20、含有歧義鹼基或測序結果、與初始引物序列及接頭序列不匹配的數據。採用Quantitative Insights Into Microbial Ecology(2.1版本，Rob Knight實驗室和Greg Caporaso實驗室，美國)完成微生物多樣性分析，其中相似度在97%及以上的測序條帶被聚類為一個操作分類單元(operational taxonomic units, OTUs)，將最終得到的所有OTUs導入資料庫Ribosomal Database Project中進行物種分類。
1.5 統計學處理
採用SPSS 19.0等軟體進行統計學分析。計量資料採用均數±標準差表達，計數資料採用百分數表示。t檢驗用於比較不同組患者年齡是否存在差異，卡方檢驗用於比較不同組患者的性別、疾病類型及病情活動度的構成比。主成分分析(principal component analysis, PCA)根據兩樣本在二維坐標圖上兩點距離遠近反映兩樣本組成的相似程度，相似性分析(計算軟體R)用於檢驗組間差異是否大於組內差異，香農指數用於評估菌群α多樣性，不同組間香農指數的差異分析採用單因素方差分析(SPSS 19.0)，Metastats分析用於不同組腸道菌群物種構成的兩兩比較。P＜0.05為差異有統計學意義。
2結果
2.1 一般臨床資料
共35例符合納入和排除標準的中重度UC患者入選本研究，均為E2或E3型，規律口服美沙拉嗪(愛的發製藥公司，中國上海)治療，1 g/次，3次/d或4次/d。激素組與無激素組的年齡、性別、病變範圍、疾病活動度均無統計學差異(表1)。無激素組共20例患者，其中7例接受口服激素或免疫抑制劑治療，13例於入院後接受足量靜脈激素治療，根據治療3 d後的病情活動度評分，將該組患者進一步分為治療有效組(8例)和治療無效組(5例)，二者年齡、性別、病變範圍、疾病活動度亦無統計學差異(表1)。
2.2 腸道菌群的基本組成
中重度UC患者的糞便菌群中，厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)和梭桿菌門(Fusobacteria)為主要組成部分，相對豐度之和超過99%。在屬水平，20個菌屬的相對豐度超過1%(圖1)。
2.3 激素組與無激素組患者腸道菌群物種組成比較
激素組與無激素組患者腸道菌群的α多樣性無統計學差異(香農指數:無激素組3.57±0.73，激素組3.03±1.15，t=1.603，P=0.123，圖2A)。
PCA分析的直觀對比顯示，兩組患者的腸道菌群組成相似(圖2B);相似性分析顯示，激素組和無激素組的組間差異小於組內差異(R=-0.002)，且組間差異無統計學意義(P=0.419，圖2C)。
激素組和無激素組患者腸道菌群在門和屬水平的構成無顯著差異(圖2D,2E)。
2.4 激素療效不同患者的腸道菌群比較
激素治療有效組和無效組的腸道菌群α多樣性無統計學差異(香農指數:有效組3.69±0.61，無效組3.15±1.01，t=1.219，P=0.248，圖3A);PCA分析直觀顯示兩組患者腸道菌群組成相似(圖3B);相似性分析提示，組間差異大於組內差異(R=0.128)，但組間差異無統計學意義(P=0.114，圖3C)。治療無效組的放線菌門及乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、Peptoclostrdium屬的相對豐度顯著低於有效組，而變形菌門及志賀菌屬、普雷沃氏菌屬類群9的豐度則顯著高於有效組(圖3D,3E;表2)。
來源於《協和醫學雜誌》
3討論
本研究通過菌群測序和分析，比較有/無激素暴露、激素治療有效/無效的中重度活動期UC患者的腸道菌群差異。研究發現，有/無激素暴露的中重度UC患者腸道菌群α多樣性及組成無統計學差異，靜脈激素治療有效/無效患者的腸道菌群α多樣性亦無統計學差異;但無效組變形菌門、志賀菌屬和普雷沃氏菌屬類群9的相對豐度顯著高於有效組，而放線菌門、乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和Peptoclostrdium菌屬的豐度則顯著低於有效組。
本研究提示，中重度UC患者的腸道菌群構成與GC療效有關，這與已有的UC治療與腸道菌群相關性的研究結果一致，即激素治療有效者的菌群豐度顯著高於治療無效者，且療效佳者糞便菌群失調指數較無效者更低。普拉氏梭桿菌的豐度與5氨基水楊酸製劑、抗腫瘤壞死因子α製劑或激素類藥物的療效相關，在抗腫瘤壞死因子α治療過程中，隨著患者症狀的改善，普拉氏梭桿菌的豐度不斷增高。與從未接受過藥物治療的IBD患者比較，接受過藥物治療患者腸道中球形梭菌與直腸真桿菌的相對豐度顯著升高。美沙拉嗪治療則可使志賀菌屬的豐度顯著下降。
在本研究中，足量靜脈激素治療有效和無效患者的多個菌屬豐度存在差異。治療有效組中含量較高的乳桿菌屬和雙歧桿菌屬是公認的益生菌，這兩個菌屬在IBD患者中的相對豐度較非IBD患者低，兩菌屬中的特定菌種已作為益生菌製劑，用於包括IBD在內的胃腸道疾病的調理和治療。相反，治療無效組中含量較高的志賀菌屬和普雷沃氏菌屬類群9則可加重腸道炎症。糞菌中志賀菌屬含量的升高，與外周血中白細胞介素(interleukin，IL)1β、 IL-6、IL-8、IL-4、IL-17等促炎症因子以及腸道內幹擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)的表達增加呈正相關。普雷沃氏菌屬也可以通過促進上皮細胞分泌IL-6、IL-8等炎症因子或激活Toll樣受體，增強輔助性T細胞17(helper T cell 17,Th-17)介導的慢性黏膜炎症作用。GC主要通過調控炎症因子表達和免疫細胞增殖分化降低機體炎症水平。IBD患者的促炎因子IL-6過表達及炎症調節因子caspase-3、IL-10減少均與GC治療無效相關]。據此推測，中重度UC患者腸道菌群中具有保護作用和促炎作用的細菌構成比例可能與激素治療效果相關，且腸道菌群可能通過調節腸道內炎症因子而對激素療效產生影響。
本研究存在一定的局限性。首先，採用16S rRNA擴增子測序僅能檢測到菌屬水平。其次，激素治療組患者根據療效進行亞組分析，各亞組病例數較少，分析結果易受其他因素如患者的年齡、性別、疾病活動度、疾病病型等幹擾。
綜上所述，中重度E2或E3型UC患者腸道菌群的α多樣性和構成可能與激素暴露無關，而腸道菌群的構成可能是靜脈糖皮質激素療效的潛在預測指標。
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