山西醫科 大學第一 醫院 (030001) 李雲燕
中南大學湘雅二醫院盧放根
大同大學醫學院侯恆張義平
【摘要】 目的觀察嗜酸乳桿菌對潰瘍性結腸炎( UC)小鼠結腸黏膜黏液細胞、黏蛋白MUC2 的表達，了解其治療 UC 的效果及可能作用機制。方法 60隻 BALB/ c小鼠隨機分為健康對照組、嗜酸乳桿菌（高、低劑量） 組、陽性對照（美沙拉嗪）組、陰性對照（凍幹賦形劑）組、模型對照組。健康對照組自由飲水，其餘各組自由飲用3 % 葡聚糖硫酸鈉 7 d造模，同時給予嗜酸乳桿菌、美沙拉嗪灌胃治療。黏液組織化( A學B/P AS) 法計數結腸黏液細胞；免疫組織化學檢測黏蛋白 MUC2 的表達抵；採用反轉錄聚合酶鏈反應( PCR) 檢測 MUC2 的基因表達。結果 模型對照組、陰性對照組與健康對照組相比小鼠結腸黏液細胞數、黏蛋M白UC2 含量減少 ，MUC2 的基因表達下降；嗜酸乳桿菌和美沙拉嗪不同程度增加結腸黏液細胞數量、黏蛋白含量，促進MUC2的基因表達，嗜酸乳桿菌高劑量組效果較顯著。結論 嗜酸乳桿菌對急性期UC小鼠有治療作用，療效與劑量呈正相關；其機制可能與嗜酸乳桿菌促使結腸黏膜 MUC2 的表達上調和結腸黏膜中黏液細胞數量增多有關。
【關鍵詞】結腸炎，潰瘍性； 益生菌； 黏液細胞； 粘蛋白；MUC2
The effect of lactobacillus on mucous cell in mice with ulcerative colitis LI Yun-yan*，L U Fang-gen , HOU Heng,ZHANG Yi-pi,ng.*First Hospi,tal of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001,China
[ Abstract 】 ObjectiveTo observe the effects of lactobacillus on mucous cells and the expression of mucin MUC2 in colonic mucosa of mice with Ulcerative Colitis (UC). To find the effect and possible mechanism of treating UC with lactobacillus. Methods Sixty BALB/c mice were randomly divided into normal control, lactobacillus tr eatment (high dose, low-da,e), positive control (mesalazine), negative control (excipient), and model control groups. The experimental mice of the acute stage of UC were induced by drinking 3% dextran sulfate sodium (DSS) freely for 7 consecu tive days, and were treated with lactobacillus or Mesalazine. AB/PAS, immunohistochemistry, and reverse transcrip tion-polymerase chain reaction (RT-PCR) were used to count the number·of mucous cells, and the.content of mucin MUC2 and the level of MUC2 mRNA was tested respectively. Results The number of mucous cell and mucin MUC2 (the level of protein and mRNA) were both decreased in model control and negative control groups compared with nor mal control group, while they were increased in lactobacillus treatment and positive control groups, especially the high dose lactobacillus treatment group. Conclusion Lactobacillus had therapeutic effects on the acute UC mice effectively, and it showed a positive correlation between the dosage and the efficiency. Its potential mechanism may be related to up regulation of MUC2 and increasing the amount of mucous cell in colonic mucosa.
[Key words 】Colitis , ulcerative;Probiotics;Mucous cell; Mucin;MUC2
潰瘍性結腸炎( ulcera tive colitis, UC)的病因和發病機制尚不十分清楚，治療缺乏特異性。化學藥物柳氮磺阰唗( SASP)、激素及免疫抑制劑，通過抑制炎症及免疫反應只能達到暫時控制和緩解臨床症狀的目的，並不能針對病因治療，且需長期服藥維持緩解。長期用藥副作用大、患者依從性差、停藥後容易復發（復發率> 50% )[1-3] 。因此，尋找治療UC 新的藥物和方法已逐漸成為熱點。大量的臨床和基礎研究發現UC患者腸道中細菌微生態平衡失調和黏膜炎症之間存在相關性 [ 4, 5 ), 微生態製劑治療UC也逐漸受到重視。本研究觀察不同益生菌——嗜酸乳桿菌對DSS誘導小鼠結腸炎症的治療作用時，分析其對黏液細胞、黏蛋白MUC2 的影響，並從黏膜保護角度探討其可能機制。
1.材料與方法
1.1 動物分組及處理：60隻 BALB/c小鼠，清潔級，雌性， 隨機分為健康對照組、嗜酸乳桿菌高劑量組、嗜酸乳桿菌低劑量組、陽性對照（美沙拉嗪）組、陰性對照（凍幹賦形劑） 組、模型對照組，每組10 只。健康對照組自由飲水，其餘各組自由飲用3%DSS 7 d 建立急性UC動物模型。於第1 天起每日2次分別給予嗜酸乳桿菌 1 x 108 CFU/ mL、嗜酸乳桿菌1 x 107 CFU/mL、美沙拉嗪27.8 mg/ mL、凍幹賦形劑1.1mg/mL, 每次0.2 mL灌胃。模型對照組不予任何處理。
1.2 試劑和儀器：AB/PAS 染色試劑盒購自福州邁新生物技術有限公司，黏蛋白 MUC2 抗體購自 Santa Cruz 公司，SP試劑盒購自北京中杉生物技術有限公司，MUC2 引物、β-actin引物由北京鼎國生物技術有限公司合成。生物顯微鏡、聚合酶鏈反應( PCR)儀、紫外分光光度計等。
1.33 疾病活動指數( DAI) 積分：評估結腸炎活動程度：參照 Hamamoto 等[ 6 ] 標準，進行 DAI 積分評分，見表1。
1.4 組織學損傷評估：根據 Dieleman 等[ 7 ] 評分標準：炎症：無(0分）、輕(度1分）、重(度2分）；病變深度：無(0分）、黏膜下層(1分）、肌層(2分）、漿膜層(3分）；隱窩破壞：無(0分）、基底1/ 3 隱窩被破壞(1分）、基底2/ 3隱窩被破壞(2分）、僅有完整表面上(皮3分）、全部隱窩和上皮被破壞(4分）；病 變範圍：1% - 25 %記1分、26% - 50 % 記2分、51%- 75 %記3分、76% - 100%記4分。每個切片隨機選取至少9個高倍視野(400倍）進行計分，取平均值作為結腸組織學損傷計分。
1.5 黏液組織化學染色：石蠟組織切片行AB/PAS染色， 高倍鏡下計數陽性染色細胞，隨機計數10個視野，取平均值。結果表示方法：每100個結腸上皮細胞中含黏液細胞數。
1.6 黏蛋白MUC2免疫組織化學：按照SP染色試劑盒說明書步驟進行，其中以磷酸鹽緩衝液( PBS) 代替一抗作陰性對照。結果判斷：以胞質中出現棕黃色顆粒為陽性，計算機圖像分析系統自動記錄陽性細胞平均吸光度。
1.7 MUC2基因表達 ：Trizol 法提取組織RNA, 逆轉錄合成cDNA, 反轉錄( RT)-PCR半定置法檢測 MUC2基因表達。PCR反應條件：94℃預變性5 min,94℃變性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸45 s, 共30個循環，72℃共延伸10min;聚丙烯醯胺凝膠電泳，凝膠成像系統檢測 PCR 產物與β-actin的比值。
1.8統計學處理:採用單因素方差分析，經SPSS13.0 統計軟體處理，以P < 0 .05 為差異有統計學意義。
2.結果
2.1 小鼠一般情況及DAI積分：正常組小鼠毛色光澤，活動進食正常；飲用DS.5 後出現毛色乾枯，活動減少，精神萎靡，並出現稀便，隨實驗天數增加症狀逐漸加重，嚴重小鼠肛周出現肉眼血便，伴有體質量下降。結果顯示各組DAI 積分均較正常組升高，差異有統計學意義( P < 0 .05 ) ;益生菌組與模型組比較 DAI 積分降低，差異有統計學意義( P < 0.05)。
2.2 各組小鼠結腸組織黏液細胞的比較：黏液染色結果以每100個上皮細胞中陽性細胞計數，見表 2。正常組 黏液細胞數為(50士 7) 個 ，陰性對照組和模型組分別為 (30土 4) 個、(29士 4 ) 個，與其比較差異有統計 學意義( P < 0.05 )。益生菌和美沙拉嗪治療後陽性細胞數不同程度增加，嗜酸乳桿菌高劑量組優於低劑量組 ，差異有統計學意義( P < 0 .05 ) 。
2.3 各組小鼠結腸病理組織學( HS)評分比較：光鏡下正常組小鼠結腸黏膜完整，黏膜上皮連續，腺體結構清楚，排列規則，杯狀細胞無減少，無炎症細胞浸潤；模型組與陰性對照組黏膜缺損，上皮缺失，腺體破壞嚴重，結構紊亂，可見杯狀細胞嚴重減少，炎症細胞浸潤；嗜酸乳桿菌與美沙拉嗪治療後黏膜不同程度修復，炎症細胞減少，組織學評分降低，差異有統計學意義( P < 0. 05) ,見表 3。
2.4 各組小鼠結腸組織黏蛋白 MUC2 表達的比較：正常組結腸組織黏蛋白MUC2 的表達量高 0. 356士0. 025,陰性對照組和模型組低分別為0.184士0 .033 、0.176 士 0 .0 28, 嗜酸乳桿菌和美沙拉嗪治療後，其表達量均增高，與之比較差異有統計學意義( P < 0. 05)。以嗜酸乳桿菌高劑量組效果最為顯著 ，表達量為0.289士 0.044, 並且與黏液細胞數量趨勢一致，見第8頁表4。
2.5 各組小鼠結腸組織MUC基因表達：RT-PCR半定量方法檢測結腸組織 MUCEmRNA的表達。正常組小鼠結腸黏膜MUCE處於高表達水平，飲用DSS後表達量不同程度下降 。嗜酸乳桿菌組和陽性對照組其表達量均增加 ，差異有統計學意義(P<0.05)。其中嗜酸乳桿菌高劑量組治療效果較低劑量組好，差異有統計學意 義(P<0.05)，見圖1
A：正常組；B：嗜酸乳桿菌 10 組；c：嗜酸乳桿菌 1O 組；D：陽 性對照組 ；E：陰性對照組 ；F：模型對 照組。a：與 陰性對照 組 、DSS 組比較 P<0．05；b：與 陽性對照組 比較 P<0．05；C：與嗜酸乳杆 菌 1O 組 比較 P<0．05。d：與正常組 比較 P<0．05。
圖1各組小鼠結腸 MUC2基因表達情況比較
3.討論
UC是一種慢性非特異性結腸炎，目前治療以水楊酸類和糖皮質激素類等藥物為主。Pena等[ 8 ]使用Lactobacilluspp治療白細胞介素 (IL)一10-/- 小鼠炎症性腸病(IBD)模型，能顯著減輕胃腸道炎症反應。Cui等[9]給UC患者口服益生菌膠囊，糞便中嗜酸乳桿菌和青春雙歧桿菌數量大為增加，2個月後復發率明顯低於安慰劑組。然而並非所有腸道內的共生益生菌都能治療UC。Schultz等[10]發現，E．Coli Nissle 1917對於急性UC小鼠沒有治療作用。K0kesava等[ll]觀察到 ，應用不同的益生菌治療UC所獲得效果不完全相同，L．caseiDN 114001在緩解實驗動物體質量降低和組織損傷方面效果更好，而E．coli083和 E．coliNissle1917 調節腸道免疫功能效果更佳。本研究用嗜酸乳桿菌治療DSS誘導的結腸炎小鼠模型發現嗜酸乳桿菌能改善小鼠的一般狀況，減輕臨床症狀(使 DAI積分下降)和病理學損害(組織損傷評分下降)。這種療效與嗜酸乳桿菌的量呈正比，同時可達到美沙拉嗪的治療效果，在減輕臨床症狀方面優於美沙拉嗪。這與Geier等[12]研究結果相似。
有研究顯示，腸道益生菌與黏膜免疫關係密切[13]，因此，針對調節免疫方面的研究較多。而對有黏膜保護作用的主要分子黏蛋白和細胞(黏液細胞)報導的尚少。如 Mack等[14]體外實驗發現向結腸癌細胞株分化HT-29細胞的培養液中加入益生菌 L．plantarum 299V 和L.GG，HT-29細胞表達MUC2、MUC3增加，並且能阻止致病性大腸桿菌侵入HT29細胞。說明益生菌誘導腸上皮細胞表達黏蛋白，抑制了致病菌黏附腸上皮細胞及向腸黏膜內移位，避免腸道免疫細胞的激活和炎症因子的釋放 ，從而發揮腸道黏膜保護作用 。體內研究發現益生菌 VSL#3C15J可使腸腔內黏蛋白含量增加 60％，並且可以刺激分離的結腸襻黏蛋白分泌和MU基因表達。上述結果顯示益生菌可能影響結腸黏膜的黏液分泌。本研究從細胞和基因兩個層面進行分析，發現嗜酸乳桿菌可使損傷的結腸黏膜組織中的黏液細胞數增加，且與嗜酸乳桿菌的量呈正比。同時發現嗜酸乳桿菌可從基因轉錄水平及翻譯水平提高 MU的表達量，說明嗜酸乳桿菌可提高黏液的分泌和細胞數量 ，從而產生治療作用。
綜上所述 ，嗜酸乳桿菌對急性UC有治療作用 ，療效優於美沙拉嗪；其機制可能與嗜酸乳桿菌促使結腸黏膜 MUC2表達上調和結腸黏膜中黏液細胞增多有關。
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(收稿 日期 ：2008-10-22)
作者簡介 ：李雲燕 ，女 ，1982年 1月生 ，在讀碩士，山西醫科大學第一醫院，030001
本文轉載於山西醫藥雜誌2009年1月第38卷第1期上半月ShanxiMedJ.january2009，VoI．38，NO.1 the First