...發明的「夏洛克」,在伊波拉檢測中大顯身手,為何沒用於新冠病毒...

2020-12-01 騰訊網

2019年底，武漢市出現因新型冠狀病毒（2019-nCoV）感染導致的肺炎疫情，截至2月10日中午，全國已有超過4萬人感染，並造成超過1000人死亡，感染人數和死亡人數均超過SARS，且還在持續增加中。

疫情暴發初期，用於確診的real-time PCR檢測試劑盒供應不足，導致許多疑似病例遲遲不能確診。近期檢測試劑盒供應量上來後，不少案例發現，試劑盒檢測為陰性的，實際已經感染新冠病毒，而且，real-time PCR檢測耗時長、操作複雜，難以滿足快速增長的疑似病例排查需求。對於武漢此次爆發的急性病毒性疫情來說，檢測試劑盒的靈敏性、檢測速度、價格、操作簡便性等缺一不可。那麼，有沒有效果更好、速度更快、價格更低的病毒檢測方法呢？答案是肯定的，不僅有，而且已經在拉沙熱、伊波拉、寨卡病毒、登革熱等疫情中大顯身手。

SHERLOCK技術的發明

CRISPR/Cas系統是細菌和古菌特有的免疫系統，是生命進化歷史上，細菌和病毒進行鬥爭產生的免疫武器，用於抵抗病毒或外源性質粒的侵害。當外源基因入侵時，該防禦系統的 CRISPR 序列會表達與入侵基因組序列相識別的 RNA，然後 CRISPR 相關蛋白（Cas，一種核酸內切酶）在序列識別處切割外源基因組DNA，從而達到防禦目的。

CRISPR技術是在20世紀90年代初發現的，2013年2月15日，張鋒等人將CRISPR/Cas9系統成功應用於哺乳動物和人類細胞的基因編輯，此後迅速成為人類生物學、農業和微生物學等領域最流行的基因編輯工具。

根據效應核酸酶組成的亞基數量，CRISPR/Cas系統可以分為兩類：第一類系統的核酸酶由多個亞基組成；第二類系統特別受關注，其核酸酶由單一的蛋白組成，包括基於Cas9、Cas12和Cas13效應蛋白的II、V和VI型。其中，與大多數Cas蛋白不同，Ⅵ型系統的核酸酶Cas13是一種依賴於RNA靶向的RNA核酸酶，專一的切割RNA，不切割DNA，在分子診斷方面具有重要的應用價值。

世界上許多最常見或致命的人類病原體都是RNA病毒（例如伊波拉病毒，寨卡病毒，愛滋病病毒，流感病毒等）此次在武漢爆發的新型冠狀病毒，同樣是RNA病毒。

2017年4月，CRISPR基因編輯大牛張鋒，在Science雜誌發表論文，發明了基於CRISPR/Cas13的病毒檢測技術。

張鋒將這種檢測技術命名為——SHERLOCK，這一與神探夏洛克·福爾摩斯同名的檢測技術，可以讓被切割的RNA形成條帶，形成視覺可見的線索，並直觀展示出來。

SHERLOCK（specifichigh-sensitivity enzymatic reporter unlocking）

相比於傳統的real-time PCR檢測，SHERLOCK檢測技術準確度更高，而且價格和檢測所需時間也減少了一半。

張鋒，CRISPR領域的奠基人之一，最早將CRISPR應用於哺乳動物和人類細胞

SHERLOCK大顯身手

2018年，非洲奈及利亞爆發拉沙病毒，張鋒所在的Broad研究所與奈及利亞展開合作，使用SHERLOCK檢測技術檢測拉沙病毒。由於尼日尼亞經常發生斷電，而聚合酶鏈式反應（PCR）檢測對電力依賴強，而SHERLOCK對於斷電不像PCR對斷電那麼敏感，再加上SHERLOCK成本更低，時間更快，大大提高了病毒檢測效率。據估計，SHERLOCK檢測技術的應用，幫助減少了對奈及利亞拉沙病毒60%的死亡率。

Jennifer Doudna：CRISPR領域的奠基人之一

此外，CRISPR基因編輯奠基人Jennifer Doudna和她在伯克利的團隊也開發了基於CRISPR/Cas12a的檢測技術，用於檢測人乳頭瘤病毒（HPV）病毒。Jennifer Doudna希望這一檢測工具能夠幫助遏制宮頸癌死亡人數的上升，對於發展中國家和非洲等地的國家，疾病通常被診斷發現時已經太晚。

南美洲國家宏都拉斯和美國加州的科學家正在測試針對登革熱病毒、寨卡病毒和與癌症相關的人乳頭瘤病毒（HPV）毒株的CRISPR檢測診斷。

2018年，非洲剛果民主共和國爆發新的伊波拉疫情，張鋒的同事、SHERLOCK檢測技術的負責人、Broad研究所研究員Parson Sabeti第一時間對來自感染者的病毒樣本進行了測序，從DNA數據中清楚確定了病毒傳播的途徑。參與這項工作的許多科學家在這次疫情中感染死亡，但換回了更多生命。她因此被評為《時代周刊》2014年度人物，當之無愧的「伊波拉鬥士」。非洲剛果民主共和國也正在進行一項針對伊波拉病毒的CRISPR檢測的探索性研究。

特別值得一提的是，Jennifer Doudna團隊和張鋒團隊之間雖然正在進行的激烈的專利爭奪戰。但雙方均表示，他們致力於授權CRISPR檢測工具，以便需要這些診斷的人可以使用它們。

SHERLOCK還能消滅病毒

2019年10月10日，麻省理工學院和哈佛大學Broad研究所的Pardis C. Sabeti、張鋒等人在Cell子刊Molecular Cell雜誌發表了題為：Programmable Inhibition and Detection of RNA Viruses Using Cas13 的研究論文。

Parson Sabeti、張鋒等將Cas13的抗病毒活性與其診斷能力結合起來，建立了一個強大和快速可編程的診斷和抗病毒系統，命名為CARVER(Cas13輔助的病毒表達和讀出限制)，以檢測和消滅人類細胞中基於RNA的病毒。該系統將來可能用於診斷和治療病毒感染(包括由新病毒和新興病毒引起的感染)。

註：CARVER，Cas13-assistedrestriction ofviralexpression andreadout，同時，CARVER也有雕刻師的意思。

研究人員通過實驗測試了Cas13在分別感染了三種不同RNA病毒的人類細胞中的活性：淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、甲型流感病毒(IAV)和皰疹性口炎病毒(VSV)。研究人員將Cas13基因片段和一種工程化的引導RNA導入細胞，24小時後，將細胞暴露在病毒中。再過24小時後，Cas13酶使細胞培養中的病毒RNA水平降低了多達40倍。

研究小組進一步研究了Cas13對病毒感染性的影響——換句話說，剩餘的病毒有多少可以繼續感染人類細胞。數據表明，在病毒暴露8小時後，Cas13將流感病毒的傳染性降低了300多倍。為了增加診斷需求，研究人員還採用了基於Cas13的核酸檢測技術SHERLOCK（specifichigh-sensitivityenzymaticreporter unlocking）。這個三合一的CARVER系統可以快速測量樣品中病毒RNA的剩餘水平。這項研究表明，基於CRISPR/Cas13的基因編輯工具，不僅能用於病毒的快速檢測診斷，還能用於清除病毒，治療病毒引起的疾病。

國內相關研究情況

2018年3月12日，中科院上海植物生理生態研究所王金博士等在Cell Research雜誌上發表了題為：CRISPR-Cas12a has both cis- and trans-cleavage activities on single-stranded DNA 的研究論文。

該研究深入系統地研究了Cas12a對於靶標ssDNA和非靶標ssDNA的切割特性。表明Cas12a可用於對單鏈DNA病毒的快速檢測。

值得一提的是，該研究論文投稿時間比Jennifer Doudna團隊的類似研究論文投稿時間更早，這也說明我國在CRISPR領域已經達到國際領先水平。

結語對於大多數傳染病來說，診斷需要專業的知識，先進的設備和充足的電力 ，而這些要求在許多爆發疫情的地方都達不到。對於快速爆發的病毒性疫情，快速檢測和確診現得尤為重要，早一分一秒，就意味著更早一些控制疫情蔓延，減少人員傷亡。

基於CRISPR的病毒檢測工具提供了與傳統方法一樣、甚至更高的診斷準確率，並且非常簡單易操作，檢測所需時間也縮短一半。對於此次武漢新型冠狀病毒疫情，SHERLOCK檢測技術本應大顯身手。至於為什麼沒有用SHERLOCK進行檢測，原因可能比較複雜。

不過好消息是，日前科技部發布《新型冠狀病毒現場快速檢測產品研發應急項目申報指南》，該指南指出目前正在使用的real-time PCR檢測技術雖然在新冠病例確診和疑似病例排查中發揮了重要作用，但是受操作複雜、耗時長、需集中送檢等限制，不能滿足當前快速增長的大量疑似患者、無症狀感染者的排查診斷需求。

因此，科技部發布此次應急項目申報指南，面向社會廣泛徵集新型冠狀病毒的現場快速診斷產品，突破目前限制，縮短檢測時間、提高便捷程度，推動診斷遷移下移。最後，希望國產的基於CRISPR的病毒快速檢測診斷產品儘快上市。

參考內容：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2019.09.013

https://doi.org/10.1126/science.aam9321

https://doi.org/10.1038/s41422-018-0022-x

相關焦點

  • 前線視野|曾戰勝伊波拉病毒的醫生怎麼看新冠病毒
    扛過病毒後，她發誓要竭盡所能去提高伊波拉患者的治療水平，以及幫助其他倖存者。截至4月底，感染新冠病毒的全球死亡人數超過了19萬人。Okoli說，她希望政府可以為未來的疾病暴發做更充分的準備，用心聽取公共衛生專家的建議。以下是她的自述：我仍然記得那是奈及利亞的第一例伊波拉病例。
  • 澳發明20分鐘新冠病毒血液檢測方法
    本文轉自【科技日報】；科技日報北京7月20日電 （記者劉霞）據美國《每日科學》網站近日報導，澳大利亞科學家發明了一種簡單的新冠病毒檢測新方法，可在約20分鐘內，使用血液樣本檢測出某人是否感染了新冠病毒。
  • 「基因編輯」技術檢測新冠病毒,獲美國緊急授權
    最晚會在夏天面世 5月7日，美國食品藥品監督管理局緊急授權了以CRISPR/Cas基因修飾技術為原理的新冠病毒檢測試劑盒 文丨實習記者 蔣模婷財新記者 馬丹萌 「基因編輯」工具也可用於新冠病毒檢測了。5月7日，美國食品藥品監督管理局（FDA）緊急授權了以CRISPR/Cas基因修飾技術為原理的新冠病毒檢測試劑盒。這是美國FDA授權的首款該類型試劑盒。
  • 張鋒的新檢測法!2小時內現場判斷病毒種類,有望用於新冠的檢測
    世界上許多最常見或致命的人類病原體都是RNA病毒（例如2019-nCoV，伊波拉病毒，寨卡病毒，愛滋病病毒，流感病毒等），然而，這些病毒中只有2.5%具有可被Cas9靶向的DNA中間體，因此，使用RNA和DNA
  • 非洲驚現神秘病毒,排除新冠和伊波拉,專家警告:或比新冠更致命
    據最新消息顯示，全球累計確診新冠肺炎病例已經超過8011萬，累計死亡人數已經超過175萬，單日新增確診超過65萬。現在隨著天氣越來越冷，全球第二波疫情也越來越嚴重，現在許多國家迫於疫情壓力已經二度封國。
  • 新冠病毒檢測為何出現假陰性?
    為何試劑盒檢測會頻頻出現假陰性？就此問題，多位專家向《中國新聞周刊》解釋，試劑盒檢測結果不僅與試劑盒質量有關，還與新冠病毒自身的特點、採樣部位、採樣量、運輸和儲存環節，以及實驗室檢測條件和人員操作有關，由多種原因構成，非常複雜，但其中最關鍵的因素，與這次病毒的特殊性有關。
  • 新冠病毒抗體檢測為何越來越重要
    新華社北京4月9日電 新聞分析：新冠病毒抗體檢測為何越來越重要　　新華社記者彭茜 郝亞琳　　輕輕扎破手指，取一滴血，滴在檢測卡樣本孔內並滴加稀釋液，15分鐘後便可通過觀察反應線出現與否，判斷自己是否曾感染新冠病毒。
  • 戴上口罩就能測新冠 還能隨處識別病毒！哈佛MIT這發明逆天了
    他帶領的科研團隊從2014年起研究應對流行病的措施，並曾在2016年發布一種能快速檢測到伊波拉病毒的傳感器，並且應用到了寨卡病毒疫情中。2018年，該團隊的傳感器已經可以檢測非典、麻疹、流感、C型肝炎、西尼羅河等多種病毒；還獲得了強生公司的5萬美元資助，用於開發可嵌入式病毒檢測傳感器。現在，他們再次運用已有的經驗技術，來研究關於新冠病毒的識別方法。
  • 張鋒團隊推出新冠病毒CRISPR檢測技術
    今年2月，張鋒教授和他的合作夥伴曾經開發出一項基於CRISPR的新冠病毒檢測技術，不需要複雜的設備，三步檢測僅需約1個小時，就能檢查出新冠病毒RNA的存在。這款最新的檢測手段比2月份的檢測技術更進一步，檢測過程中不需要從患者樣本中純化RNA，並且將檢測新冠病毒所需的化學反應步驟在一個試管中完成。
  • 伊波拉病毒比新冠還要可怕,死亡率超高,令人膽寒!
    即使人類因為一些成績已經變得非常偉大，但面對微小的病毒還是無能為力。看情況，人類現在僅僅戰勝了天花這一種病毒，這沒什麼可值得驕傲的，因為還有很多病毒都沒有消滅。就比如伊波拉病毒，這個曾經引起全人類巨大恐慌的病毒，到現在依然是大家頭痛的難題。這種病毒究竟可怕到了什麼程度呢？
  • 她抗非典、戰伊波拉，如今又挑戰上了新冠
    、炭疽病...這些病毒有時不僅僅是天災，更有可能被用於戰爭和恐怖襲擊。疫苗在獅子山投放臨床使用，最終控制住了伊波拉病毒的蔓延和傳播。幾天後，陳薇團隊應用自主研發的檢測試劑盒，配合核酸全自動提取技術，加上緊急展開的帳篷式移動檢測實驗室，很快實現了新型冠狀病毒快速檢測。
  • 可在30分鐘內出結果的伊波拉病毒檢測新方法
    日本長崎大學熱帶醫學研究所日前宣布，該所研究人員開發出了高效檢測伊波拉病毒的方法。
  • 「伊波拉之父」確診新冠:「病毒終於要復仇了」
    據英國《衛報》等媒體13日報導，3月中旬，倫敦衛生與熱帶醫學院院長、病毒學家彼得·皮奧特（Peter Piot）確診感染新冠肺炎，他在醫院住了一周，此後一直在倫敦家中等待康復。皮奧特說：「我的一生都在與病毒作鬥爭，病毒終於要復仇了。」皮奧特表示：「我和一個無家可歸的人、一個來自哥倫比亞的清潔工和一位來自孟加拉國的患者同住一間病房。我們連說悄悄話的力氣都沒有，所以只能度過孤獨的夜晚。生死之間，我還冒出了『恢復之後我會怎麼樣』的想法。」
  • FDA首次批准CRISPR用於新冠檢測,由基因編輯先驅張鋒團隊開發
    在當前的新冠病毒大流行中，對COVID-19的診斷測試成為追蹤疾病傳播的重要工具。此前，世界衛生組織(WHO)多次敦促衛生機構將新冠病毒檢測作為應對大流行的首要任務，但國際社會的反應並不一致。監管和準備的結合使得一些國家，如韓國和新加坡，能夠迅速部署成千上萬的測試——但在其他地方，衛生機構一直難以跟上步伐。而美國一開始，由於醫院積壓，企業製造商推遲了數周才開始行動，隨後大學研究實驗室著手開發自己的診斷方法，以滿足迫切的需求。
  • 科普：病毒大搜捕——新冠病毒與核酸檢測
    電子顯微鏡樣本的準備非常繁瑣的，而且檢測的成本也非常高，還需要現在實驗室專門去培養一管新冠病毒，再把它放到電子顯微鏡下觀察，這樣才比較靠譜，不像今天用核酸檢測就可以快速而便宜地發現病毒。冠狀病毒家族都有一個蛋白質的外殼，直徑60到220納米，新冠病毒的直徑大概在90到100納米左右，是屬於中間大小的體型。它們的結構最外面主要是刺突蛋白，也叫S蛋白，它對於新冠病毒能夠感染人這件事情起到最為重要的作用。冠狀病毒的內部是由一條單鏈RNA構成的遺傳物質。冠狀病毒家族中最早被發現的病毒是在1937年，它是在雞的身上發現的，而在人的身上發現是1965年。
  • 張鋒教授團隊推出新一代新冠病毒CRISPR檢測技術,讓即時檢測更便捷
    今年2月，張鋒教授和他的合作夥伴曾經開發出一項基於CRISPR的新冠病毒檢測技術，不需要複雜的設備， ，就能檢查出新冠病毒RNA的存在。　　這款最新的檢測手段比2月份的檢測技術更進一步，檢測過程中不需要從患者樣本中純化RNA，並且將檢測新冠病毒所需的化學反應步驟在一個試管中完成。
  • 西方出現未知新病毒!最有發言權的醫生警告:比新冠病毒更致命
    據外媒本月24日報導，非洲大陸出現一種未知病毒，在剛果（金）偏遠小鎮，一名當地女性表現出與伊波拉出血熱相似的早期症狀，該女子和她的兩個孩子接受了伊波拉病毒檢測，結果均為陰性。之後，檢測結果被送到剛果（金）國家生物醫學研究所（INRB），以待進一步分析，接診該患者的醫生認為，這名女子是一種新未知病毒的"零號病人"。
  • 伊波拉病毒:比新冠厲害,致死率是SARS病毒的9倍
    它也屬於病毒。但是我們今天要說的既不是新型冠狀病毒，也不是SARS病毒，而是一種更加可怕的，可以稱之為病毒之王，只要感染上基本就會被判定為死亡的病毒——伊波拉病毒（Ebola virus）。伊波拉病毒的可怕程度：伊波拉病毒也稱作伊波拉病毒，當年的SARS病毒已經非常可怕了，致死率達到11%。
  • 分子計算機檢測伊波拉病毒和馬爾堡病毒
    根據世界衛生組織的最新報告，早期發現是減緩伊波拉病毒爆發的關鍵，例如目前正在西非蔓延的伊波拉疫情，估計已經感染了近1000人 。研究人員說，分子計算機有朝一日可以簡化生物醫學分析的分析，就像那些用於診斷伊波拉病毒的分析一樣。
  • 張鋒教授團隊開發新冠病毒CRISPR檢測技術,三步檢測僅需約1個小時
    它僅需純化的核酸分子樣本，通過簡單的三步，就能在1個小時的時間裡完成檢測。由於這項技術還比較初步，尚未在真實患者樣本中做過檢測，因此科學家們也強調，這個方法目前不能用於臨床上對新冠病毒感染的診斷。在2017年的《科學》論文中，研究人員們指出，這套系統無論對RNA還是DNA，靈敏度都達到了單分子級。 檢測新冠病毒的技術原理 從原理上看，這項技術並不難理解。SHERLOCK的核心是一種叫做Cas13a的酶和與其結合的嚮導RNA。