Exosomeladen oxygen releasing antioxidant and antibacterial cryogel wound dressingOxOBand alleviate diabetic and infectious wound healing
作者：Parvaiz A. Shiekh, Anamika Singh, Ashok Kumar. (Biomaterialand Tissue Engineering Group, Department of Biological Sciences andBioengineering, Indian Institute of Technology Kanpur, Centrefor Nanosciences, Indian Institute of Technology Kanpur, Centrefor Environmental Sciences and Engineering, Indian Institute of TechnologyKanpur)
發表情況：Biomaterials 2020 Aug 249:120020, doi:10.1016/j.biomaterials.2020.120020
ADSCs外泌體和釋氧抗氧化支架促進成纖維細胞和角質形成細胞的附著、存活、遷移和增殖；
Exosome包埋釋氧敷料OxOBand促進糖尿病大鼠創面閉合率、再上皮化和肉芽組織形成；
OXOBand促進糖尿病創面膠原重塑、血管生成和降低氧化應激；
OXOBand釋放氧促進糖尿病感染創面修復。
缺氧、血管化減少、氧化應激升高和感染是慢性糖尿病傷口無法癒合的重要臨床特徵。因此，輸送氧氣、誘導血管生成、管理氧化應激和感染可能為糖尿病創面癒合提供新的和改進的治療途徑，以獲得更好的臨床結果。在這裡，研究者報告了一種富含氧的外泌體釋放抗氧化劑創面敷料OxOBand的開發和評估，以促進糖尿病傷口的閉合和皮膚再生。OxOBand由抗氧劑聚氨酯(PUAO)組成，是一種具有持續釋氧性能的高孔隙率冷凍凝膠，並補充了脂肪來源的幹細胞(ADSCs)外泌體。被細胞吞噬的外泌體促進了人角質形成細胞和成纖維細胞的遷移，提高了人神經母細胞瘤細胞在高血糖條件下的存活率。與未經治療的糖尿病對照傷口相比，OxOBand在兩周內促進了傷口更快的閉合，增加了膠原沉積，更快的再上皮化，增加了新生血管，並降低了氧化應激。該敷料可促進成熟上皮結構的發育，毛囊和表皮形態與健康皮膚相似。在具有臨床挑戰性的糖尿病感染傷口中，這些敷料防止感染和潰瘍，通過增加膠原沉積和再上皮化來促進傷口癒合。總之，OxOBand是促進糖尿病傷口癒合的一種非常新的治療策略，並可能導致治療糖尿病潰瘍的新的治療幹預措施。
Lack ofoxygen, reduced vascularization, elevated oxidative stress, and infection arecritical clinical hallmarks of non-healing chronic diabetic wounds. Therefore,delivering oxygen, inducing angiogenesis, and management of oxidative stressand infection may provide newer and improved therapeutic avenues for betterclinical outcomes in diabetic wound healing. Here, we report the developmentand evaluation of an exosome laden oxygen releasing antioxidant wound dressingOxOBand to promote wound closure and skin regeneration in diabetic wounds.OxOBand is composed of antioxidant polyurethane (PUAO), as highly porouscryogels with sustained oxygen releasing properties and supplemented withadipose-derived stem cells (ADSCs) exosomes. Exosomes engulfed by the cellsenhanced the migration of human keratinocytes and fibroblasts and increased thesurvival of human neuroblastoma cells under hyperglycemic conditions. OxOBandfacilitated faster wound closure, enhanced collagen deposition, fasterre-epithelialization, increased neo-vascularization, and decreased oxidative stresswithin two weeks as compared to untreated diabetic control wounds. The dressingpromoted the development of mature epithelial structures with hair folliclesand epidermal morphology similar to that of healthy skin. In clinicallychallenging infected diabetic wounds, these dressings prevented infection andulceration, improved wound healing with increased collagen deposition, andre-epithelialization. Altogether, OxOBand is a remarkably newer treatmentstrategy for enhanced diabetic wound healing and may lead to novel therapeutic interventionsfor the treatment of diabetic ulcers.
圖1 脂肪幹細胞(ADSCs)外泌體的分離與鑑定
(A)分離外泌體的方法。(B)納米顆粒跟蹤分析(i)顯示的是相對於大小的外泌體的顆粒/毫升，以及背景中的外泌體的散射圖像。Western blot(ii)顯示CD81標記存在於外泌體中，而不存在於細胞裂解物中。此外，β肌動蛋白在胞外泌體中不存在，而在細胞裂解物中存在。透射電子顯微鏡(TEM)圖像(iii)顯示外泌體的雙層膜泡狀結構，呈杯狀。比例尺：200 nm。鈣調素AM染色的外泌體(iv)顯示被HaCaT細胞包裹的完整的外泌體結構。比例尺：10μm(C)雷射共聚焦掃描顯微鏡圖像顯示(i)HaCaT和(ii)NiH3T3細胞包裹PKH_(26)標記的外泌體(紅色)。比例尺：20μm。
圖2 脂肪來源的幹細胞(ADSCs)外泌體促進角質形成細胞的遷移
(A)試驗時間表。(B)與未處理的細胞相比，外泌體處理可促進HaCaT細胞的遷移。術後12h、18h、24h、36h的典型影像顯示傷口閉合。(C)外泌體組HaCaT細胞的移行率和創面復蓋率均明顯高於對照組(P<0.0 5)。(i)顯示不同時間點傷口閉合情況的直方圖。(ii)表示HaCaT細胞在外泌體處理後的遷移率的代表圖。(D)Calcein AM染色的活細胞成像顯示HaCaT細胞在不同時間點的傷口閉合。數據表示為Mean±S.D.(平均值±標準差)。實驗分三組(n≥3，*p≤0.0 5，**p≤0.0 1，*p≤0.001)。
圖3 (A)SH-SY5Y細胞在高血糖條件下的存活情況。SH-SY5Y細胞用外泌體預處理6h，然後用高糖(150 MM)處理。(I)MTT實驗顯示，在高血糖條件下，外泌體存在時，代謝活性增強。(Ii)鈣黃綠素AM/PI活(綠)/死(紅)細胞完整性分析顯示，外泌體處理可提高SH-SY5Y細胞在高血糖條件下的細胞存活率。(B)(I)Calcein AM(綠色)/PI(紅色)染色顯示HaCaT細胞存活的代表性圖像。外泌體處理對H_2O_2誘導的HaCaT細胞氧化應激具有保護作用。(Ii)細胞活性的量化表明，在氧化應激下，外泌體處理可提高存活率。(C)PUAO-CPO-EXO和PUAO-EXO支架的胞外泌體釋放動力學。(D)鈣黃素AM/PI染色顯示細胞在PUAO和PUAO-CPO支架上附著。兩種支架均能促進HaCaT和NIH3T3細胞的附著和遷移。(E)支架對氧化應激下細胞存活的影響。(1)鈣黃素AM/PI染色顯示氧化應激下NIH3T3細胞在PUAO和PUAO-CPO支架上的存活增強。(Ii)細胞活力的量化。數據表示為Mean±S.D.(平均值±標準差)。實驗分三組(n≥3，*p≤0.0 5，**p≤0.0 1，*p≤0.001)。
圖4 負載外泌體PUAO-CPO支架加速糖尿病大鼠創面閉合
(A)糖尿病誘導和隨後傷口誘導和癒合的實驗設計。用高脂飼料餵養大鼠，腹腔注射鏈脲佐菌素誘導糖尿病。糖尿病誘導4周後製作創面，觀察創面閉合情況2周。(B)傷後立即以及傷後第0天、第4天、第8天和第14天的傷口的代表性圖像。藍色圓圈表示第0天的傷口區域，並在不同的日期疊加在圖像上。(C)第4天、第8天和第14天殘餘創面的量化。創面閉合率顯示，外泌體處理和釋氧支架與糖尿病和非糖尿病對照組相比，癒合速度更快。所有數據均以均值±標準差表示(n≥5，ns：不顯著，*p≤0.0 5，**p≤0.0 1，*p≤0.001，*p≤0.0001)。
圖5 外泌體載氧釋放支架(PUAO-CPO-EXO)可促進體內組織再生
(A)(左)第14天未支架、PUAO、PUAO-CPO、PUAO-EXO和PUAO-CPO-EXO處理的傷口的代表性H&E圖像(比例尺：2毫米)。(右)高倍圖像顯示肉芽組織形成和上皮組織閉合。成熟的皮膚結構，如毛囊和皮脂腺，可以在外泌體處理的動物中看到(比例尺：2 0 0μm)。創面組織HE染色顯示14天後創面完全閉合。(B)14天後收穫的組織標本中肉芽組織形成的定量。與空白傷口相比，支架處理的動物可觀察到更厚的肉芽組織形成。氧氣和外泌體處理顯著促進了肉芽組織的形成。(C)量化傷口中心的平均表皮厚度。PUAO和PUAO-CPO處理組動物表皮厚度增加，提示表皮分化。由於表皮成熟，PUAO-EXO和PUAO-CPO-EXO動物的外泌體厚度較小。所有數據均以平均值±標準差表示。(n≥5，ns：不重要，*p≤0.05，**p≤0.01，*p≤0.001)。
圖6 外傷後14天，外泌體富氧釋放支架促進膠原沉積和重塑
(A)馬森三色染色組織切片的代表性圖像，顯示成纖維細胞增生和膠原沉積。(左)PUAO-EXO和PUAO-CPO-EXO動物(比例尺：2 mm)創面膠原沉積完整(藍色染色)，所有支架處理組均可見膠原沉積增強。PUAO組和PUAO-CPO組創緣距離較對照組明顯減小。PUAO-EXO組和PUAO-CPO-EXO組動物創面邊緣完全閉合。(右)放大圖像顯示PUAO-CPO-EXO動物傷口邊緣完全閉合。此外，還可以觀察到成熟的皮膚結構，如毛囊和腺體(比例尺：200μm)。(B)天狼星紅染色顯示支架處理的傷口中膠原沉積和重塑。印跡天狼星紅染色：放大圖像顯示支架處理動物I型膠原(天然膠原，紅色)與III型膠原(未成熟膠原，綠色)沉積增加(比例尺：2 0 0μm)。I型膠原和III型膠原重塑的定量顯示，在富含抗氧化劑和氧氣釋放的外泌體支架中，I型膠原重塑增加。所有數據均以平均值±標準差表示。(n≥5，ns：無差異，#p≤0.05)。
圖7 外泌體載氧釋放支架可減輕氧化應激，增加新生血管，促進表皮分化
(A)8-OHdG免疫染色顯示經PUAO-CPO-EXO處理的創面氧化應激降低(比例尺：50μm)。(B)CD31CD31型免疫螢光染色顯示，與糖尿病和非糖尿病對照相比，釋放氧氣的抗氧化劑和載氧的外泌體抗氧化劑支架中的新生血管增加(比例尺：50μm)。(C)CK10免疫螢光顯示損傷組織再上皮化和表皮分化。外泌體負載抗氧化劑和放氧抗氧化劑支架(比例尺：20μm)均可觀察到復層的新生上皮。
圖8 外泌體載氧釋放支架可促進糖尿病感染性傷口的癒合、再生和預防感染
(A)實驗設計。用高脂飼料餵養大鼠，鏈脲佐菌素誘導糖尿病。糖尿病誘導4周後，在大鼠背部形成創面。用1×108個銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌按1：1的比例感染創面，3d後創面形成感染和潰瘍，之後用PUAO-CPO-EXO支架處理創面，對側創面保持空白。再生觀察21d。(B)7、15和21天後傷口閉合的代表性圖像。PUAO-CPO-EXO處理的創面比空白創面癒合快。此外，PUAO-CPO-EXO支架可防止後續感染。(C)組織學H&E染色顯示肉芽組織形成，創面完全閉合(比例尺：2 mm)(左)。放大圖像顯示錶皮重塑並形成成熟的上皮結構(比例尺：200μm)(右)。(D)馬森三色染色的傷口組織顯示，與糖尿病感染對照組(標尺：2毫米)相比，外泌體載氧釋放支架(PUAOCPO-EXO)處理的動物膠原沉積增加(藍色)。還觀察到毛囊和腺體的形成(比例尺：20 0μm)(右)。(E)天狼星紅染色示PUAO-CPO-EXO處理的傷口外泌體膠原重塑增強。I型膠原沉積增強表明，由於外泌體負載支架(標尺：2 mm)(左)，膠原重塑。PUAO-CPO-EXO處理組動物(標尺：200μm)(右)可觀察到特徵性的膠原編織結構。所有數據均以平均值±標準差表示。(n≥5，*p≤0.05，**p≤0.01，*p≤0.001)。