CRISPR基因編輯揭開面紗嶄露頭角

2020年10月7日下午，諾貝爾獎化學獎授予了基因編輯領域的兩位先驅，詹妮弗 ·杜德納和埃馬紐爾·夏彭蒂耶，獲獎理由是 「發明了一種基因組編輯的方法」。

毫不誇張地說，這個喜訊在科學界迅速成為了最熱門的話題。

CRISPR是英文Clustered regularly interspaced short palindromic repeats的縮寫，中文意思是成簇的、有規律間隔的短回文重複序列，簡單點就是基因序列編輯器，是近年來發展起來的可以對基因組完成精確修飾的一種技術。

下面簡單介紹下CRISPR這個神仙技術的簡史

1993年

CRISPR的發現及其功能

弗朗西斯科·莫吉卡（Francisco Mojica）是第一個描述現所謂的CRISPR基因座的研究者。他發現完全不同的重複序列其實是具有一組共同的特徵，即現在已知的CRISPR序列的特徵，在2002年首次在印刷品中使用了CRISPR一詞。

此外，他們還指出，與病毒基因有同源性的間隔區，在一端都有一個共同的序列。這個序列，原間隔基序（PAM）是目標識別所必需的。

Cas9和PAM的發現

Bolotin正在研究嗜熱鏈球菌的細菌，它剛剛被測序，揭示了一個不同尋常的CRISPR位點。儘管CRISPR陣列與先前報導的系統相似，但它缺少一些已知的cas基因，而含有新的cas基因，其中一個基因編碼是他們預測具有核酸酶活性的大蛋白，即現在所知的Cas9。

2006年

自適應性免疫假設方案

Eugene Koonin通過計算分析研究一組同源蛋白質，並提出了一個假設方案，將CRISPR級聯作為細菌免疫系統，其基於與噬菌體DNA同源的插入物，推翻了先前關於Cas蛋白可能包含一個新的DNA修復系統的假設。

此外，他們還發現Cas9可能是幹擾所需的唯一蛋白質，CRISPR系統通過這個過程使入侵的噬菌體失活。

自適應免疫的實驗演示

科學家們想通過噬菌體來製造酸奶，並在乳製品工業中廣泛使用。Horvath和他的同事通過實驗證明了CRISPR系統確實是一個適應性免疫系統。

2008/8

間隔子序列被轉錄為指導RNA

約翰·范德奧斯特等科學家們開始詳細說明CRISPR-Cas系統是如何「幹擾」入侵的噬菌體的。他們指出在大腸桿菌中，源於噬菌體的間隔序列被轉錄成小RNA，稱為CRISPR RNAs，引導Cas蛋白質到達目標DNA。

marrafini和Sontheimer在他們的論文中明確指出，如果這個系統能夠被轉移到非細菌系統中，那麼這個系統將是一個強大的工具。

CRISPR作用於DNA靶

Luciano Marrafini和Erik Sontheimer，他們證明了目標分子是DNA，而不是RNA。許多人認為CRISPR與真核生物的RNA沉默機制類似，後者以RNA為靶點。

2010年

Cas9切割目標DNA

Moineau和他的同事證明CRISPR-Cas9在精確的位置，即PAM上遊的3個核苷酸處，在靶DNA中產生雙鏈斷裂。他們還證實了Cas9是CRISPR-Cas9系統中進行切割所需的唯一蛋白質。

他們發現除了crRNA外，還存在第二個小RNA，他們稱之為反式激活CRISPR RNA-tracrRNA。他們表明tracrRNA與crRNA形成雙鏈體，而正是這種雙鏈體將Cas9引導至其靶標。

發現用於Cas9系統的tracrRNA

關於自然CRISPR-Cas9引導的幹擾機制的最後一個難題來自Emmanuelle Charpentier。他們對化膿鏈球菌進行了小RNA測序，該鏈球菌具有含Cas9的CRISPR-Cas系統。

2011/7

CRISPR系統可以在其他物種中異源發揮作用

Siksnys和同事從嗜熱鏈球菌（II型系統）克隆了整個CRISPR-Cas基因座，並在大腸桿菌（不包含II型系統）中表達了這一點，他們證明了它能夠提供質粒抗性。

這表明CRISPR系統是獨立的單元，並證實II型系統的所有必需組件都是已知的。

他們還指出，crRNA可以縮減到20 nt的伸展，足以有效切割。

Cas9介導的裂解的生化表徵

利用異源系統， Siksny和他的團隊從大腸桿菌攜帶嗜熱桿菌CRISPR基因的大腸桿菌菌株中，用crRNA與crRNA複合純化了Cas9，並進行了一系列生化實驗，以表明Cas9的作用模式，他們驗證了PAM的裂解位點和要求，並使用點突變，他們顯示RuvC域切割非互補鏈，而HNH域切割互補位點。

2013年

CRISPR-Cas9用於基因組編輯

麻省理工學院麥戈文腦研究所的張峰在其他基因組編輯系統上工作，他是第一個成功地將CRISPR-Cas9用於真核細胞基因組編輯的人。張先生和他的團隊設計了兩種不同的Cas9同源序列（來自嗜熱鏈球菌和化膿鏈球菌），並在人和小鼠細胞中展示了靶向基因組切割。

從那時起，研究人員發現CRISPR/Cas9具有驚人的多功能性。科學家們不僅可以利用CRISPR將基因剪除，從而「沉默」，還可以利用修復酶將所需的基因替換到狙擊手留下的「洞」中。

CRISPR基因編輯技術，自誕生以來短短幾年時間內，已成為近年來生命科學領域最耀眼、最受關注的技術，也一直被視為諾貝爾獎的有力競爭者。

科學家們用人工RNA來切割Cas9蛋白。這種酶會搜索任何具有相同代碼的目標，而不僅僅是病毒，然後開始切割。在2012年一篇具有裡程碑意義的論文中，Doudna、Charpentier和martinjinek展示了他們可以使用CRISPR/Cas9系統在任何他們想要的地方切割任何基因組。

基因編輯本身並不新鮮。編輯基因的各種技術已經存在多年了。CRISPR之所以如此具有革命性，是因為它是非常精確，Cas9酶通常隨您所願而行。而且它非常便宜且容易，過去，改變一個基因可能要花費數千美元以及數周甚至數月的操作。現在，它的價格可能僅為75美元，並且只需幾個小時。

CRISPR，是原核生物的自我防禦系統，檢測特定的致病核酸，幹擾外源DNA的功能，保護它們免受外來入侵。近年來，CRISPR因其特有的等位基因特異性在體外診斷領域吸引了越來越多的關注，對癌基因突變和單核苷酸變異檢測方面具有潛在診斷能力。

基於CRISPR / Cas的體外診斷

基於CRISPR‐Cas的體外診斷平臺已經取得了快速發展，可以檢測和識別各種類型的致病因子。利用核酸是疾病有效生物標記的原理，基於CRISPR的診斷方法主要依賴於檢測與疾病相關的特定序列，然後對其進行切割以產生可讀信號。靶序列的實例包括致癌突變序列或源自感染因子的病毒和細菌序列。CRISPR系統的目標是識別特定的病原體，並通過在染色體的確切位置編輯特定的DNA序列來修復引起疾病的等位基因。

病毒診斷檢測

病毒是一種微小的感染媒介，只能在活細胞中發揮其生物學功能。它們主要由遺傳物質和蛋白質外殼組成。這些病毒顆粒的形狀各異，它們以多種途徑傳播。現有的病毒檢測方法通常是核酸擴增和檢測工具，例如PCR，其主要依賴於熱循環。儘管一次原始核酸的擴增和檢測在某種程度上是敏感和可調節的，但病毒診斷的主要困難在於它們需要大量的樣品處理和大量的機械設備。他們可能無法區分具有相似表型的相關病毒。

科學家通過CRISPR‐Cas13a開發了一種快速檢測病毒的方法，該方法利用其附帶的RNA降解功能。無需任何複雜的儀器，即可在不到一個小時的時間內完成檢測。

細菌診斷檢測

基於CRISPR‐Cas的體外診斷平臺已經取得了快速發展，可以檢測和識別各種類型的致病因子。利用核酸是疾病有效生物標記的原理，基於CRISPR的診斷方法主要依賴於檢測與疾病相關的特定序列，然後對其進行切割以產生可讀信號。靶序列的實例包括致癌突變序列或源自感染因子的病毒和細菌序列。CRISPR系統的目標是識別特定的病原體，並通過在染色體的確切位置編輯特定的DNA序列來修復引起疾病的等位基因。

基於CRISPR-Cas的腫瘤診斷測試

癌症是一種細胞異常生長的疾病，可能侵襲人類各個部位。研究人員提出了一種基於CRISPR‐Cas9的檢測DNA突變的方法，已證明CRISPR‐Cas9可以切割野生型基因組DNA。同時，由於microRNAs的表達模式與癌症有關，無細胞microRNAs在血液中絕對穩定，可用於體外診斷。科學家們開發了一種基於CRISPR-Cas9的microRNA檢測方法，用於癌症診斷，通過RCA對miRNAs進行等溫擴增，並與具有滅活核酸酶活性的Cas9突變體（dCas9）結合，用於導入特定的基因組位點，在編輯、成像等方面有著廣泛的應用。

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CRISPR優缺點

CRISPR的方法比PCR具有更多優勢，包括更短的檢測周期，等溫信號放大（無需熱循環），單核苷酸靶標特異性，無需複雜的儀器等。CRISPR系統具有獨特的能力，可以迅速地重組來診斷由新發病毒引起的傳染病。基於CRISPR的快速診斷解決方案能夠精確檢測冠狀病毒家族成員的突變菌株。因為在流行病學研究中快速，及時地檢測感染者中的病毒非常重要，因此有必要開發出控制病毒擴散的診斷方法。除此之外，能夠檢測無症狀感染以及病毒突變株也具有其重要性。

用於設計CRISPR中的指導RNA的序列是從菌株之間的保守區域中選擇的，所以即使病毒發生突變，基於CRISPR-Cas的診斷測試也能夠檢測到它。由於該測試是基於病毒基因組的診斷，因此可以在感染的任何階段使用，尤其是在潛伏期的早期階段檢測，而無需進行其他確認性測試。而PCR測試是無法在感染後立即檢測到病毒，需要時間來增加病毒的載量。因此在感染早期容易得到假陰性結果。

但是，CRISPR-Cas系統的主要缺點是sgRNA與被研究生物的基因組非特異性結合（脫靶現象），從而導致信號差和對結果的誤解。

自從CRISPR基因組編輯和診斷工具出現以來，很多公司紛紛開始開發利用CRISPR技術的商業化IVD產品。

ITL是生命科學和體外診斷領域的技術和產品創新者，在激烈的市場環境下，憑藉40多年的技術積澱和400多項IVD開發的成功經驗能夠根據客戶和市場需求，靈活運用創新技術，為客戶提供定製化的儀器開發和設計服務。ITL對診斷儀器的開發有自己獨特的解決方案，產品開發時充分考慮其未來的使用場景和可用性，貫徹系統化的風險管理。我們的總部位於英國，並在美國和中國設立分公司，為全球醫療診斷客戶提供一站式IVD產品開發服務。無論您的項目處於開發流程的任何階段，我們都歡迎您前來交流和探討。