最近不斷遇到CDMO用戶、創新藥用戶和科研用戶諮詢∆G檢測問題,關於生物製品∆G檢測,一句話:
國外製藥同行和科學家測∆G測得如火如荼,國內也躍躍欲試,但大部分用戶對此卻不甚了解。
所以,今天就來跟大家聊聊∆G什麼來頭,什麼作用,為何老闆、客戶點名要檢測。1
1 迎面逼來的∆G
● 最大限度地提高蛋白天然構象穩定性並防止聚集,對於蛋白質療法、蛋白質藥物製劑、工藝開發條件、質量控制以及基礎蛋白質科學研究至關重要。一般來說,需要在以下兩個環節考察判斷蛋白聚集趨勢:
1)設計或選擇具有最佳穩定性的突變或蛋白質變體;
2)選擇最佳溶液(製劑)使得蛋白構象穩定性最大化、聚集程度最小化。
● 蛋白質溶液的長期穩定性通常受到蛋白質聚集體存在的影響。不同的機理和動力學過程可以解釋這些聚集體的形成。聚集體的潛在來源之一正是變性蛋白的存在,即使在製備蛋白質溶液後不久,溶液中變性蛋白質的含量很小,它也可能有聚集的趨勢,並最終成為「吞噬所有天然蛋白質的黑洞」[1]。這個過程通常用Lumry-Eyring模型來描述[2],如下:
N: Native protein; U: unfolded protein; F: Final state
● 確定最佳的蛋白質變體或最佳配方需要能夠及早測量變性蛋白質和聚集的變性蛋白質含量。新鮮製劑中變性蛋白的數量非常少(通常小於總蛋白的0.01%),立即直接測量變性蛋白含量是非常困難的,無法通過常規技術檢測到。常用的加速穩定性或強制降解試驗基本上可以將變性和聚集的含量推到可測量的水平,然而即便可以檢測,也僅是檢測到「中途」現象,仍無法幫助判斷蛋白聚集成分、聚集路徑和長期穩定性;最能撥雲見日預見未來的還是依賴於天然構象和解摺疊構象之間平衡的測量方法,即吉布斯自由能(∆G)的測定,不僅允許計算溶液中變性蛋白質含量(小於總蛋白質的0.01%),由於聚集和構象平衡是熱力學聯繫在一起的,∆G的蛋白質濃度依賴性又為評估配方中蛋白質聚集傾向和聚集路徑提供了關鍵信息。在蛋白候選分子或製劑篩選的第一天就可以量化蛋白構象穩定性併科學預測蛋白聚集穩定性。
綜上,∆G的重要性已經赤裸到不測不行了,是不是有一種相見恨晚的感覺?
2 到底什麼是吉布斯自由能(∆G)
「吉布斯自由能是一個系統在恆溫恆壓下,對外做可逆功或最大功的能力。1876年,約西亞·威拉德·吉布斯(josiahwillard Gibbs)定義了一個熱力學性質,用來預測一個過程是否會在恆定的溫度和壓力下自發發生。ΔG對於自發過程為負值,對於非自發過程為正值,對於處於平衡狀態的過程為零」,翻譯一下即:反應物要發生狀態改變,需要足夠的自由能量。
(https://www.thoughtco.com/definition-of-gibbs-free-energy-605869)。
打住,咱們不補高中化學,回到生物製品穩定性中的ΔG,如下繼續:
3 ΔG與蛋白結構穩定性有什麼關係
任何蛋白在任何緩衝液、任何溫度下都處於自然摺疊狀態和變性狀態之間的平衡,即天然蛋白、變性蛋白含量比例一定(平衡常數K),這種平衡比例正是由構象穩定性(∆G)決定。
∆G為蛋白解摺疊需要的自由能,可以理解為蛋白由天然狀態轉變為解摺疊狀態需要克服的能障:∆G越高,解摺疊需要的能量越高,蛋白越不容易變性,天然構象越穩定。
用於製劑篩選和開發的蛋白將主要以天然構象(∆G>0)存在,變性蛋白含量通常非常少。通過測量∆G反映變性蛋白含量。ΔG越高,變性蛋白含量越少。例如,∆G為8 kcal/mol的生物製品含有1ppm變性蛋白質[4]。對於生物製品,理想情況下,所選擇的結構和配方應優化到更高的∆G,即最大限度地增加天然蛋白質,使變性蛋白質的含量最小化。
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4 其實,∆G高不是終極目標,∆∆G才是幕後Boss
如前所述,蛋白聚集的潛在來源之一是變性蛋白,變性蛋白通常很容易聚集,最終形成粒子和沉澱。這種聚集和沉澱對蛋白溶液長期穩定性是一種風險,將天然狀態-變性狀態蛋白的化學平衡向右推動,並進一步減少溶液中天然蛋白質的含量,如下圖,反應向右進行。
如何判斷變性蛋白是否發生聚集?在不存在蛋白質聚集或自締合的情況下,蛋白質去摺疊的ΔG是一個與蛋白質濃度無關的單分子過程,如果ΔG的變化是蛋白質濃度的函數,則說明存在蛋白聚集,因為聚集是一種依賴濃度的締和現象,因此評估是否存在聚集或自締合的實驗是測量不同蛋白質濃度下的∆G 。ΔG隨蛋白濃度變化而變化,這裡稱為ΔG趨勢,即ΔΔG或ΔGtrend 。一般來說,如果∆G與蛋白濃度無關,則不存在蛋白聚集;如果∆G隨蛋白濃度降低,則存在變性狀態蛋白聚集,而如果∆G隨蛋白濃度增加,則存在天然狀態蛋白聚集。如下圖,展示了Trastuzumab(左)和Cetuximab(右)的∆G濃度依賴性[1]:在5% dextrose條件下Trastuzumab的∆G隨蛋白增加而增加,這表明存在天然狀態蛋白聚集,與已知結果一致;而Cetuximab的∆G隨濃度增加而降低,表明變性蛋白發生聚集。
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5 知道很重要,決定很重視,但究竟如何測?
● 一個公認的測定∆G的方法即等溫化學變性(Isothermal Chemical Denaturation, ICD),將蛋白與一系列濃度化學變性劑(尿素或鹽酸胍)孵育,測量化學變性劑存在條件下蛋白質變性程度。實驗證明∆G與變性劑濃度呈簡單的線性關係。
∆G0:不存在變性劑時蛋白吉布斯自由能;m:吉布斯自由能隨變性劑濃度變化率;[denaturant]:變性劑濃度
● 另一種測定∆G的方法是差示掃描量熱法(DSC)。然而,由於許多蛋白質,特別是單克隆抗體的熱變性是熱力學不可逆的,因此不能用DSC來測量其熱力學穩定性[3]。
● 化學或熱變性等預測技術是生物製劑開發過程中評估穩定性的關鍵組成部分。兩者都加速了蛋白展開過程,但化學變性是可逆的,是唯一能夠量化熱力學穩定性的方法,而且化學變性可以在更具生物學意義的溫度下進。化學變性可以在不同的蛋白質濃度下進行,從而可以直接測量∆G的濃度依賴性,即∆Gtrend。5
6 功能強大的自動化ICD系統 —— HUNKY
● 原理:蛋白與化學變性劑孵育,隨著變性劑濃度升高,蛋白發生解摺疊,螢光胺基酸基團微環境改變 ,導致發射螢光光譜改變,HUNKY通過捕捉並分析螢光信號來計算ΔG和變性蛋白比例。
●效率:自動化配製不同變性劑濃度反應體系,自動檢測、分析蛋白變性信號;可同時檢測14個蛋白分別在24個製劑中的ΔG或者檢測4個蛋白的ΔGtrend。這個通量的手動操作工作量是不敢想像的。
結果舉例
1. ΔG靈敏鑑別阿達木單抗穩定性:
2. ΔGtrend揭示阿達木單抗緩衝體系選擇真相
阿達木的商業配方是檸檬酸-磷酸鹽,並含有其他賦形劑以穩定製劑,降低蛋白聚集趨勢。但不難看出該緩衝體系∆G不是最高的,何以勝出?決勝點是ΔGtrend 最小,說明變性蛋白聚集趨勢最低,製劑長期穩定性良好。
因此,從熱力學的觀點來看,製劑優化策略追求的是一種同時使∆G最大化並最小化其對蛋白質濃度依賴性,即ΔGtrend最小的配方組合。
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重點總結
● ΔG越高,蛋白結構越穩定,溶液中變性蛋白含量越少,所選擇的蛋白變體和配方應優化到更高的∆G。
● 但最優條件不只追求∆G最大化,而是使變性蛋白聚集趨勢最小化,控制聚集的「導火索」。
● ∆Gtrend可以在生物製品開發早期科學預測聚集穩定性和聚集路徑,更接近長期穩定性真實情況。
參考文獻:
Arne Schon, Denatured state aggregation parameters derived from concentration dependence of protein stability,Analytical Biochemistry 488 (2015) 45-50;
Jose M. Sanchez-Ruiz, Theoretical analysis of Lumry-Eyring models in differential scanning calorimetry,Biophysical Journal Volume 61 April 1992;
A. Schon, R.K. Brown, B. Hutchins, E. Freire, Ligand binding analysis and screening by chemical denaturation shift, Anal. Biochem. 443 (2013) 52-57;
Determine aggregation propensity with ΔGtrend and the HUNK,HUNKY application note.
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