自從2017年兩款CAR-T產品相繼上市以來，過繼細胞療法（ACT）持續升溫。美國、中國和日本成為該領域的佼佼者。美國癌症研究協會年會（AACR）作為全球規模最大的腫瘤領域學術盛會之一，自然少不了對此研究進展的報導。
今年AACR的ACT研究總共分為四個「section」，收錄了共66篇相關摘要。我們摘取了幾個主題進行前瞻性分析：3D腫瘤模型在ACT中的應用、NK細胞治療、CRISPR基因編輯的應用，以及14天T細胞「速成法」。
1.過繼細胞療法（ACT）
過繼細胞療法（adoptive cell therapy, ACT）是指從患者體內分離出具有活性的免疫細胞，在體外進行改造（或不改造）和擴增，重新輸入到患者體內以達到治療疾病（以腫瘤為主）的目的。
人體內免疫細胞種類繁多，每種免疫細胞扮演的角色也各不相同。因此，過繼細胞療法主要包括TIL、LAK、CIK、DC、NK、TCR-T和CAR-T等。
提起細胞療法，國人的第一印象也許是2016年的「魏則西事件」。事件大致經過：某些醫院過度宣傳，收取高昂費用，採用未經臨床驗證的DC-CIK療法，導致患者「無力回天」。DC-CIK療法雖然理論上沒有問題，而實際上還有很多科學問題尚未解決。這也導致我國細胞療法的發展一度「沉淪」。然而，「魏則西事件」並未讓細胞療法停滯。
2017年，美國FDA分別批准了諾華的Kymriah和吉利德的Yescarta，標誌著ACT的時代真正開啟。於此同時，TCR-T和CAR-NK等細胞療法的發展也是甚囂塵上。
2018年，諾貝爾生理醫學獎更是頒發給兩位在免疫治療方面做出巨大貢獻的科學家——安德森癌症中心的James P. Allison和日本的本庶佑教授。
2.ACT中3D腫瘤模型
2019年AACR將於3月29日至4月3日在美國亞特蘭大的Georgia World Congress Center舉行，屆時將有數萬人參加。會議的內容更是包羅萬象，囊括了實體瘤和血液瘤，基礎研究和臨床研究，新技術和新藥物等等。
眾所周知，藥物研究在臨床前都需要在細胞或者動物上預實驗。一般的細胞培養，特別是實體瘤細胞，大部分是貼附於培養瓶的表面形成細胞層，是一種二維結構（2D）。但是這種2D培養和人體內細胞的空間結構完全不一致，很難模擬出細胞處於的微環境。
因此，科學家們開發了3D球型培養（3D spheroids）。相對於2D，3D球型培養的細胞與體內的生理狀況更加相似，包括細胞間相互作用、細胞增殖、厭氧狀況和基因表達。而且這種模型對應藥物篩選也非常有利。
來自德國的Medigene Immunotherapies GmbH公司就開發了這樣一種模型，分別構建了腫瘤細胞系和健康原代/多功能幹細胞形成的3D球型細胞，用以評價TCR-T細胞在這兩種模型中的細胞毒性 [1]。
結果顯示：TCR-T能夠殺傷和其共培養的球型腫瘤細胞，但對健康細胞形成的細胞球沒有影響。這些結果也在2D培養中得到驗證。說明3D球型培養是一個有效體外驗證TCR-T功能的模型。
另一項來自BioDuro LLC的研究驗證了CAR-T在3D模型中的作用。該研究中用螢光標記的Raji細胞（一種淋巴瘤細胞系）來進行3D培養，隨後通過不同比例與CAR-T細胞混合培養 [2]。
通過24小時的混合培養，CAR-T能夠殺傷與其混合培養的球型細胞，而且與CAR-T細胞數量呈正比。這兩項研究同時說明3D球型細胞的培養是TCR-T和CAR-T前期藥物測試有潛力的模型。
3.NK細胞療法
人體免疫細胞裡有一群叫自然殺傷細胞（NK），是天然免疫的一道屏障，能夠抵禦病毒和細菌等外源感染。越來越多的研究也發現NK細胞在殺傷腫瘤細胞中也扮演著重要角色。
今年的AACR有5篇與NK細胞治療相關的研究，咱們一一講解。
第一篇來自Celularity，他們從人類胎盤CD34+前體細胞培養出專屬異體NK細胞（PNK）。這種細胞在眾多實體瘤和血液瘤中展示出細胞毒性，並且在AML動物模型中明顯降低腫瘤負荷 [3]。
第二篇關於開發一種長期監測NK細胞ADCC的方法。研究者利用的工具稱為Celigo成像系統，不僅能夠獲得NK細胞殺傷的全景圖，而且能更好特化靶標抗體在細胞殺傷功能上的效果 [4]。
第三篇關於體外擴增和工程化NK細胞，通過輻照的K562細胞。被K562刺激的NK細胞不僅提高了激活和生存基因的表達，而且延長了NK細胞壽命並增強了對腫瘤細胞的毒性 [5]。
第四篇關於CAR-NK在轉移性葡萄膜黑色素瘤（MUM）中的應用。表達CAR和不表達CAR的NK92細胞都能抑制MUM腫瘤模型生長，但CAR-NK檢測在肝臟中聚集，說明有可能解決MUM肝轉移的問題 [6]。
最後一篇講述了NK治療在小鼠模型上的應用。研究者在體外有條件地擴增小鼠的NK細胞。這種擴增的細胞不僅能減緩乳腺癌腫瘤模型的生長，而且可以延長小鼠的生存率 [7]。
4.ACT中CRISPR的應用
無論是CAR-T、TCR-T還是CAR-NK等細胞療法，都需要基因工程技術將靶標序列插入相應的載體。CRISPR-Cas9系統的發現，為我們提供了非常精準、廉價、易於使用的基因編輯技術。
CRISPR-Cas9技術在構建CAR-T載體等細胞療法中得到廣泛應用。今年的AACR更是有多達幾十項研究應用這項技術。我們選取其中的兩篇與細胞治療相關的摘要，分享給大家。
第一篇用CRISPR-Cas9技術編輯CAR-T細胞，靶向CD33，用以治療急性髓細胞白血病（AML）。CD33在90%以上的AML患者都有表達。在造血幹細胞表面沒有表達，在成熟的粒細胞和其他組織也沒有表達，因此CD33成為髓系白血病治療的良好靶點。
該研究開發的異體CAR-T（T細胞來自於患者以外的其他人）。有些患者免疫細胞狀態無法達到製作CAR-T的標準，而異體CAR-T的開發可能解決這種問題。但人體對異源免疫細胞的排斥是這種CAR-T應用的一道障礙。
在這項研究中，研究者利用CRISPR-Cas9技術編輯來自健康人的T細胞，將CD33抗體位點插入到TRAC基因座中，該基因的失活能降低移植物抗宿主病（GVHD）。另外，β2-微球蛋白位點也被破壞，防止CAR-T細胞被宿主免疫系統清除 [8]。
研究結果顯示：異體抗CD33的CAR-T細胞體外展現出抑制AML細胞系的強勁活性，體內也能抑制AML小鼠模型中腫瘤的生長。
第二篇研究關於應用CRISPR-Cas9技術確定和T細胞衰竭的相關基因。T細胞衰竭是導致T細胞療法在實體瘤中療效有限的主要原因之一。利用基因編輯技術可以確定哪些基因在T細胞衰竭中扮演著重要角色 [9]。
5.快速T細胞療法
雖然T細胞治療取得了卓越的效果，但對於那些生命垂危的病人來說，時間就是生命。因此，縮短細胞製備時間尤其重要。
凱特公司從提取患者細胞，到CAR-T細胞回輸進患者體內，這一過程大約需要18天，諾華的製備時間為22-29天，Juno的製備時間為24天。
來自NexImmune的研究者正在試圖解決這一問題，他們的研究結果也會發表在今年的AACR上。他們從T幹細胞、中心細胞和效應記憶細胞中分離並產生治療性的CD8 T細胞，只需要14天時間。
簡而言之，研究者利用順磁性納米微粒的aAPC，共價結合各種有利於T細胞增殖的抗體。多肽裝載這種aAPC，然後在GMP的T細胞擴增平臺上生產腫瘤特異的CD8 T細胞 [10]。
AML特異性T細胞可以從非常低頻的前體細胞擴增500到5000倍。這個系統用來生產多發性骨髓瘤（MM）特性T細胞也能達到相同的結果。通過細胞因子分析和腫瘤殺傷實驗，證實這些T細胞都是具備正常功能的。
而這些細胞最終的功能將會通過臨床試驗得以驗證，通過招募復發/難治性AML和MM患者。如果試驗得以成功，這種方法將較大程度上縮短T細胞製備的過程，對急需治療的患者大有裨益。
參考資料：
[1] Maja Buerdek, Kathrin Mutze, Kai Pinkernell, Dolores J. Schendel. Medigene Immunotherapies GmbH, Martinsried, Germany. 2303 / 2 - In vitro evaluation of TCR efficacy and toxicity using 3D spheroid models.
[2] Ruyi Li, Shanshan Gan, Leixin Zhang, Thomas Broudy, Yong Hu. BioDuro LLC, San Diego, CA. 2314 / 13 - Pharmacology studies of chimeric antigen receptor (CAR) T cells in luminescent xenograft and 3D in vitro tumor models.
[3] James Li, Xuan Guo, Hemlata Rana, Andrea DiFiglia, Joseph Gleason, Uri Herzberg, Robert Hariri, Xiaokui Zhang. Celularity, Warren, NJ. 935 - Genetic modification potentiates the antitumor activity of human placental CD34+ cells-derived NK cells.
[4] Leo L. Chan, Lucas Ferrari De Andrade, Charles A. Thomas, Dmitry Kuksin, Kai Wucherpfennig. Nexcelom Bioscience LLC, Lawrence, MA; Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA; Dana Farber Cancer Institute, Lawrence, MA. 2325 / 24 - Long term time-course monitoring of NK cell-mediated ADCC using the Celigo Image Cytometer.
[5] Mira Tohme, Sasha Lazetic, Kate Jamboretz, Luxuan Buren, Chao Guo, James Trager. Nkarta Therapeutics, South San Francisco, CA. 2304 / 3 - Expanded and engineered NK cells upregulate expression of activation and survival genes associated with increased cytotoxicity and persistence.
[6] Bao Quoc Lam, Takahito Sugase, Mizue Terai, Meggie Danielson, Nadezhda Anikeyeva, Melissa A. Wilson, Yuri Sykulev, Takami Sato. Sidney Kimmel Medical College of Thomas Jefferson University, Philadelphia, PA; Thomas Jefferson University, Philadelphia, PA.
[7] Shih-Wen Huang, Yein-Gei Lai, Jen-Qi Wu, Yae-Huei Liou, Nan-Shih Liao. Academia Sinica, Taipei, Taiwan. 2302 / 1 - Natural killer cell cancer therapy in mouse model.
[8] Brigid McEwan, Zinkal Padalia, Ashley Porras, Jason Sagert, Jonathan A. Terrett, Tony Ho, Demetrios Kalaitzidis. Crispr Therapeutics, Cambridge, MA. 1428 / 9 - Allogeneic CRISPR/Cas9 gene-edited CAR-T cells targeting CD33 show potent preclinical activity against AML cells.
[9] Jin K. Park1, David A. Canner, Rebecca Herbst, Amy Li, Olivia C. Smith, Aviv Regev, Tyler E. Jacks. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Cambridge, NY; Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, NY. 1431 / 12 - In vivo CRISPR/Cas9 screen of adoptively transferred T cells reveals novel mediators of T cell exhaustion and immunosuppression.
[10] Sojung Kim, Lauren Suarez, Emily Lu, Celine Walmacq, Daniel Dembrow, Juan Varela, Dan Bednárik, Kenneth Carter, Naimish Pandya, Kristi Jones, Mathias Oelke. NexImmune, Gaithersburg, MD. 1423 / 4 - AIM ACT, a novel nanoparticle-based technology that generates therapeutic numbers of functional tumor-specific CD8+ T cells with T stem cell, central and effector memory phenotype in 14 days.
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