儘管親和融合策略可以一步使融合蛋白的純度達到很高，但是在蛋白質的下遊處理階段又引入了新的問題，即需要位點特異的剪切。在進行融合表達時，以下三種情況是不必去除親和標籤：1. 目標蛋白作為免疫原用來產生和純化抗體；2. 目標蛋白的生物活性不受融合標籤的影響；3. 目標蛋白用來直接固定化在介質上。但如果親和標籤影響了目標蛋白的功能，或為了結構生物學研究和治療用途，就必須在融合標籤和目標蛋白之間加入特異的剪切位點，以便去除親和標籤，可用的方法有化學法和酶法，如表5 所示，在選擇這些方法時除要考慮選擇性等因素外，還要考慮標籤去除後胺基酸的殘留 ，目前C端的標籤沒有很好的方法去除，都會在目標蛋白的C端引入額外的胺基酸，針對N端標籤已有幾種蛋白酶在酶切後可使目標蛋白不帶額外的胺基酸殘基。化學方法廉價，但是常缺乏選擇性，而且使用劇烈的反應條件常使目標蛋白變性失活，使用蛋白酶的優點是反應的條件溫和（中性pH，溫度為4℃到37℃），特異性強。如果使用蛋白酶進行特異性剪切，在酶切完成後要有相應去除蛋白酶的純化方法，有的重組蛋白酶具有親和標籤，如N端帶有His標籤的腸激酶、二肽氨基肽酶和TEV蛋白酶，可在酶切後使用金屬螯合親和層析去除，N端帶有GST標籤的PreScission蛋白酶，可以用穀胱甘肽親和層析柱去除，還可以將蛋白酶固定化在介質上進行融合蛋白的酶切，使蛋白酶可重複使用。儘管如此，在進行融合蛋白的酶切時會遇到一些特殊的問題，如酶切的效率受到酶切位點空間可及性和周圍胺基酸性質的影響，常存在酶切不完全的現象；某些蛋白在酶切後會出現沉澱；使用內肽酶可引起非特異性剪切的情況，如凝血酶屬於絲氨酸蛋白酶，在精氨酸和賴氨酸殘基後剪切，最優的酶切位點為P4-P3-Pro-Arg↓P1』-P2』（P4和P3為疏水性胺基酸，P1』和P2』 為非酸性胺基酸），非特性酶切的情況在表5的注釋裡作了說明，而應用廣泛的腸激酶也存在非特異性酶切的現象（92,97）。Jenny等對凝血酶和凝血因子Ⅹa蛋白酶的應用進行了綜述，認為儘管它們在很多應用中能夠在設計的位點進行特異性酶切，但常常會發生目標蛋白其它位點的酶解，所以在去除親和標籤後要對目標蛋白進行鑑定，以確保蛋白的結構沒有發生變化（105）。正是由於酶切以及成本方面的考慮，親和融合策略在工業上應用並不廣泛。
表 5 融合蛋白的剪切方法
剪切的方法 | 剪切位點序列 | 注釋 | |
化學法 | 溴化氰 | Met^ | 需要70%甲酸，室溫 |
羥胺 | Asn^Gly | 在pH為9條件下，需要加熱，45℃ | |
甲酸 | Asp^Pro | 70%甲酸，需要加熱 | |
酶法 | 腸激酶 | Asp-Asp-Asp-Asp-Lys^ | 重組的蛋白酶，為內切酶，如果在賴氨酸後為脯氨酸則不能剪切，在其它的鹼性胺基酸殘基後有非特異性剪切，具有活性的pH範圍為4.5到9.5，溫度範圍為4℃到45℃ |
凝血因子Ⅹa蛋白酶 | Ile-Glu/Asp-Gly-Arg^ | 如果在精氨酸後為脯氨酸和精氨酸則不能剪切，為內切酶，在Gly-Arg後存在非特異性剪切 | |
凝血酶 | Leu-Val-Pro-Arg^Gly-Ser | 牛來源的含有其它蛋白質，為內切酶，存在非特異性的剪切，生物素化後可用鏈黴抗生物素蛋白親和層析清除 | |
PreScission 蛋白酶 | Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln^Gly-Pro | GST融合的鼻病毒 | |
rTEV蛋白酶 | Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln^Gly | 重組的菸草蝕紋病毒蛋白酶，具有8個胺基酸識別位點，高特異性，為內切酶，在寬的溫度範圍裡具有活性，與His-tag融合後，酶切後使用金屬螯合親和層析清除 | |
二肽基氨基肽酶 | (Xaa)2n^Xaa-Pro, (Xaa)2n^Xaa- Xaa –Pro, (Xaa)2n^Lys/Arg/Gln | 為外切酶，當終止胺基酸為Gln時，可在穀氨醯胺環轉移酶和焦穀氨醯胺肽酶的作用下去掉Gln，可產生天然的目標蛋白質，特異性強 | |