Cell最牛解析:揭秘CRISPR「中心法則」,一圖了解CRISPR系統作用全...

2007年，來自丹尼斯克公司（一家總部位於丹麥哥本哈根的食品添加劑公司，目前被杜邦公司收購）的科學家找到了一種能增強細菌防禦噬菌體能力的方法。之後2013年，四個研究團隊報告了這一被稱為CRISPR的系統，自此CRISPR技術紅紅火火的發展了起來，許多科研團隊利用它來刪除、添加、激活或抑制人體、老鼠、斑馬魚、細菌、果蠅、酵母、線蟲和農作物細胞中的目標基因。

近期來自蒙大拿州立大學的兩位學者以「CRISPR-RNA-Guided Adaptive Immune Systems」為題，介紹了CRISPR-Cas免疫應答系統。其中Blake Wiedenheft就是當年加州大學伯克利分校Jennifer Doudna研究組成員，他們曾於2010年破解了Csy4核糖核酸內切酶原子水平的晶體結構模型——研究人員確定Csy4是一種存在於原核細胞的酶，它能夠啟動生成CRISPR衍生RNAs (crRNAs)，這種小RNA分子能夠靶向並沉默侵入的病毒和質粒。

細菌和古細菌進化出了複雜的CRISPR適應性免疫系統，這一系統可以分成I-III三個類型，至少有11種不同的亞型：從I-A到I-F，從II-A到II-C，以及III-A和III-B，不過儘管有這些不同，所有的CRISPR-Cas系統都通過三個主要階段來完成功能：採集，CRISPR RNA(crRNA) 生物合成與靶向幹擾。

階段1：外源DNA採集

外源核苷酸是通過Cas蛋白來識別的，入侵的短片段DNA（30-50個鹼基對）被稱為protospacers，作為間隔序列插入宿主CRISPR位點中，由重複序列隔開。對於I型和II型系統來說，protospacers來自入侵DNA中兩側出現2-5個核酸結構（PAM，protospacer adjacent motif）的區域。一般protospacers連接在CRISPR 位點的一端，並且後者通過涉及Cas1、Cas2和游離3』-hydroxyls等元件的機制，牽引序列。Protospacer的整合過程中也出現了牽引末端重新序列複製，這可能涉及宿主聚合酶和DNA修復機制。

相關論文解析：

Multiple mechanisms for CRISPR–Cas inhibition by anti-CRISPR proteins

研究人員確定了其中三種anti-CRISPR蛋白：AcrF1、AcrF2和AcrF3的功能機制。他們對這些蛋白進行了生物化學及體內研究，證實每一個anti-CRISPR蛋白都通過不同的機制來抑制了CRISPR–Cas的活性。有兩個anti-CRISPR阻斷了CRISPR–Cas複合物的DNA結合活性，但它們是通過與不同的蛋白質亞基互作，利用了空間或非空間抑制模式來做到這一點的。第三種anti-CRISPR蛋白通過結合Cas3解螺旋酶-核酸酶，阻止其招募到結合DNA的CRISPR–Cas複合物上來起作用。在體內，這一anti-CRISPR可以將CRISPR–Cas系統轉變為轉錄遏制物，首次證實了一種蛋白質相互作用蛋白可以調控CRISPR–Cas活性。作者們認為，這些anti-CRISPR蛋白質不同的序列及作用機制表明了獨立的進化，並預示了還存在其他的方式——蛋白質藉助於它們改變了CRISPR–Cas的功能。

新研究首次探討了蛋白質抑制CRISPR–Cas系統的機制。這些多樣且不同的機制反映了病毒-宿主軍備競賽深層的進化根源。這些已知和尚有待發現的Anti-CRISPR，將為認識和操控CRISPR–Cas系統提供大量有價值的工具。其中一個例子就是，新研究發現AcrF3通過阻止招募Cas3將CRISPR–Cas系統轉變為了一個基因調控因子。由於除了破壞外源DNA，CRISPR–Cas系統來執行著各種功能，許多重要的功能有可能是由與CRISPR–Cas元件互作，由此改變了這一系統活性的蛋白質來完成。

階段2：crRNA合成

CRISPR RNA生物合成在轉錄之後，生成初級轉錄產物：pre-crRNA，之後經過加工，又成為一組短小的CRISPR 衍生RNAs（crRNAs），這些crRNAs每一個都包含有對應於之前遇到的外源DNA的對應序列。

CrRNAs導向序列兩端是相鄰重複序列區域，在I型和II型系統中，這種CRISPR轉錄產物會被CRISPR特異性核酸內切酶（Cas6 或 Cas5d）切割，切割位點位於重新序列。許多I型系統的重新序列會出現多次，因此Cas6也需要穩定連接在crRNA 3』端莖環上。對於III型系統來說，Cas6則是短暫連接，crRNA 3』端會進一步通過未知的酶處理。

II型系統中，CRISPR RNA加工過程則取決於反式作用 crRNA (tracrRNA)，tracrRNA包含一個重複序列的互補序列，這些雙螺旋區域在Cas9出現時可以通過RNase III 進行處理。

相關論文解析：

CRISPR-mediated adaptive immune systems in bacteria and archaea.

這篇發表在Annu. Rev. Biochem. 雜誌上的文章十分重要，解析了crRNA合成過程，以及其後的靶向幹擾中的幾個重要步驟，此後也被多人引用。

Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering

張鋒的這篇綜述概述了CRISPR/Cas9作為一種平臺技術的開發狀況以及在基因組編輯方面的應用，也討論了其存在的一些挑戰，以及未來的創新之路。

階段3：靶向幹擾

成熟的crRNAs能指導Cas蛋白靶向互補靶標，靶標序列由專用Cas 核酸酶降解，但其靶標降解的機制存在差異。I型和II型系統都可以靶向包含PAM和protospacer互補序列的dsDNA底物。III型系統則不依賴於 PAM作為識別序列，而是通過導向序列延伸至crRNA信號5'handle的核苷酸進行識別（CRISPR位點包含與導向序列，5'handle互補的序列），並阻止靶向切割。

相關論文解析：

Co-transcriptional DNA and RNA Cleavage during Type III CRISPR-Cas Immunity

一些數據表明，當病毒入侵細菌細胞時，稱作為III型CRISPR-Cas的這一機制會靶向病毒的DNA，阻止它利用細菌的機器來拷貝自身及感染更多的細菌。但另外的一些實驗表明，III型CRISPR-Cas只能通過切割病毒RNA來讓病毒喪失能力。

洛克菲勒大學的研究人員他們檢測了III型CRISPR-Cas對DNA和RNA的切割，結果發現了從前其他人沒有得到過的一個關鍵成分，並發現CRISPR-Cas確實切割了病毒DNA生成的RNA，但它也切割了病毒的DNA。

這種雙交叉系統有一些優勢。許多的病毒整合到它們感染細胞的基因組中保持休眠狀態，不會造成損傷。事實上，這些病毒對於細菌可能是有益的，例如它們攜帶的毒素幫助了細菌促進自身生存。舉例說來，白喉毒素是由一種細菌所分泌，但編碼這一毒素的基因卻來自於一種病毒。只有在病毒開始將它們的DNA轉錄為RNA之時才會讓它們喪失功能，通過設置這樣的要求III型CRISPR-Cas不會損及休眠病毒，使得它們可以繼續讓宿主細菌受益。

循環關閉

I型系統中，監測複合物中靶向結合會導致Cas3介導的靶向降解（直接幹擾）或最初採集，這其中涉及crRNA導向募集Cas3、Cas1 和Cas2到外源DNA處，引起新一輪的快速採集。

II型系統中雖然未觀察到最初採集，但Cas9 也是protospacer篩選的必要元件，這表明在靶向幹擾與外源DNA採集之間存在一種功能性聯繫。近期還有研究發現了編碼anti-CRISPRs 蛋白的不同病毒基因，這也是指出了幹擾以上不同階段，能顛覆CRISPRs 系統。

Cas9 specifies functional viral targets during CRISPR-Cas adaptation.

一些證據表明，某些Cas酶（未包括Cas9）自身可以操控記憶形成過程。基於Cas9識別切割位點的方式，研究人員猜測Cas9在記憶形成中也發揮了作用。

除了匹配CRISPR引導序列和病毒DNA，Cas9需要在附近尋找第二信號：病毒DNA中的前間區序列鄰近基序( protospacer adjacent motif，PAM)序列。這是一個至關重要的步驟，因為PAM序列的存在阻止了Cas9攻擊細菌自身包含記憶的DNA。

為了檢驗他們的假說，研究人員交換了化膿鏈球菌和嗜熱鏈球菌免疫系統的Cas9酶，它們各自識別不同的PAM序列。結果，PAM序列跟隨著在兩種細菌之間發生了交換——表明在記憶形成中Cas9負責了PAM的識別。

Multiple mechanisms for CRISPR–Cas inhibition by anti-CRISPR proteins

研究人員確定了其中三種anti-CRISPR蛋白：AcrF1、AcrF2和AcrF3的功能機制。他們對這些蛋白進行了生物化學及體內研究，證實每一個anti-CRISPR蛋白都通過不同的機制來抑制了CRISPR–Cas的活性。有兩個anti-CRISPR阻斷了CRISPR–Cas複合物的DNA結合活性，但它們是通過與不同的蛋白質亞基互作，利用了空間或非空間抑制模式來做到這一點的。第三種anti-CRISPR蛋白通過結合Cas3解螺旋酶-核酸酶，阻止其招募到結合DNA的CRISPR–Cas複合物上來起作用。在體內，這一anti-CRISPR可以將CRISPR–Cas系統轉變為轉錄遏制物，首次證實了一種蛋白質相互作用蛋白可以調控CRISPR–Cas活性。作者們認為，這些anti-CRISPR蛋白質不同的序列及作用機制表明了獨立的進化，並預示了還存在其他的方式——蛋白質藉助於它們改變了CRISPR–Cas的功能。

新研究首次探討了蛋白質抑制CRISPR–Cas系統的機制。這些多樣且不同的機制反映了病毒-宿主軍備競賽深層的進化根源。這些已知和尚有待發現的Anti-CRISPR，將為認識和操控CRISPR–Cas系統提供大量有價值的工具。其中一個例子就是，新研究發現AcrF3通過阻止招募Cas3將CRISPR–Cas系統轉變為了一個基因調控因子。由於除了破壞外源DNA，CRISPR–Cas系統來執行著各種功能，許多重要的功能有可能是由與CRISPR–Cas元件互作，由此改變了這一系統活性的蛋白質來完成。（生物谷Bioon.com）

生物谷推薦的英文原文

SnapShot： CRISPR-RNA-Guided Adaptive Immune Systems

DOI：http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2015.09.011

Bacteria and archaea have evolved sophisticated adaptive immune systems that reply on CRISPR loci and a diverse cassette of Cas genes that are classified into three main types and at least eleven subtypes. All CRISPR-Cas immune systems operate through three main stages： acquisition， biogenesis， and interference. This SnapShot summarizes our current knowledge of these fascinating immune systems. To view this SnapShot， open or download the PDF.