Cell | 阿爾茨海默病的空間轉錄組測序

前言

空間轉錄組測序技術因其能夠原位捕獲細胞中表達的RNA，為探究不同組織空間位置下細胞分布及基因表達特徵提供可能。此外，與傳統的原位雜交技術相比，空間轉錄組測序通量高，優勢顯著，是繼單細胞轉錄組測序技術之後，探究生物學問題的又一利器。

基本信息

樣本類型：人、小鼠腦

技術類型：Spatial Transcriptomics，In situ Sequencing

發表期刊：Cell

影響因子：38.637

背景介紹

阿爾茨海默病是發生於老年和老年前期的神經系統疾病，主要表現為記憶障礙、失語、失用、失認、視空間能力損害、抽象思維和計算能力損害、人格和行為改變等。目前阿爾茨海默病研究的一個中心問題是澱粉樣斑塊與神經退行性過程的關係，儘管在阿爾茨海默氏病（AD）的澱粉樣斑塊周圍觀察到複雜的炎症樣變化，但對其特徵的分子變化和細胞相互作用知之甚少。

研究結果

1. 技術路線

圖1

作者分別選取3月齡（3m），6月齡（6m），12月齡（12m），18月齡（18m）的AppNL-G-F（AD模型）和 C57BL/6（正常模型）小鼠腦組織，利用冰凍切片技術獲取每隻小鼠的3張連續切片，中間的一張用來做ST，其他兩張用來做免疫組化檢測。

2. 成鼠腦的ST測序

圖2

作者將每個冠狀切面與Allen Mouse brain Atlas（Lein et al.，2006）定義的14個大腦解剖區域（Fig2B）進行比對分析，並將每個TD（Tissue domain）分配到其中一個區域。通過對有效spots進行降維聚類分析，進而比較不同區域及不同樣本間基因表達的差異（Fig 2C-D）。

3. 基因表達與澱粉樣蛋白（β-Amyloid，Aβ）累積的關係

圖3

AppNL-G-F小鼠中的Aβ蛋白沉積開始於3個月左右（Fig3A）。採用TD中像素的Aβ螢光強度的標準差作為Aβ累積指數，從而區分Aβ輕度累積區和Aβ高度積累區，且這一結果與Aβ免疫染色結果一致（Fig3A-C），說明Aβ的累積從背側向腹側皮質、丘腦和海馬體逐漸增多。

4. Aβ斑塊誘導基因的鑑定

圖4

作者通過WGCNA分析，發現plaque-induced genes (PIGs)模塊在Aβ小鼠中顯著富集，這個模塊包含57個基因，這些基因在開始發生輕微上調，到12月份急劇上調，並在整個大腦中穩定表達（Fig4A-B）。此外，皮爾森相關性分析Aβ累積與PIGs的表達具有顯著相關性（Fig4C），表明PIGs的表達隨著Aβ在整個腦區的積累而逐漸增加。為了進一步確定PIGs的特徵，作者將PIGs與疾病相關/活化反應相關的小膠質基因和炎性星形膠質相關進行維恩分析，發現其中36個PIGs未被定義為疾病相關的膠質基因（Fig4D）。此外作者發現人MIC1標記基因(Fig4E-F)的小鼠同源物在Aβ暴露中的基因表達發生改變。對小鼠的分析表明，人腦中的MIC1反應是對澱粉樣斑塊的多細胞協調反應的一部分，這種反應隨時間的推移而演變。

5. PIGs模塊的ISS分析

圖5

為了實現對ST的空間解析度，作者使用各細胞類型marker和PIGs的定製探針對18m的兩個appNL-G-F和兩個WT小鼠中進行原位測序（In Situ Sequencing，ISS）分析（Fig5A-C），通過螢光點數量化基因表達，並將Aβ累積周圍的螢光點數分成5個組（ring1-ring5）（Fig5D）。進一步分析發現PIGs的54個基因，其中51個顯著富集在ring1，而C1qb在ring1中顯著缺失，與ST的結果一致（Fig5E）。為了研究PIG網絡的細胞特徵，作者開發了一種算法，通過計算5mm半徑範圍內的細胞類型標記基因的富集程度（不包括正在研究的點），將每個點分配一種細胞類型。以此來預測Aβ斑塊中的細胞類型。(Fig5F-G)。結果發現，PIGs對Aβ的反應在很大程度上與小膠質細胞有關，星形膠質細胞在一定程度上也起到了重要作用(Fig5H)。

6. PIGs模塊中小膠質細胞和星形膠質細胞基因的共表達分析

圖6

為了分析 Aβ累積異常是否驅動不同細胞中PIGs的表達。作者對PIGs進行WGCNA分析，根據Aβ指數將所有ST分為5個部分，包括WT和AD的4個區域，作者發現，WT中PIGs模塊的基因聯繫最低，隨著Aβ累積增多，PIGs網絡的相互聯繫更加密切（Fig6）。

7. OLIG模塊對Aβ累積的時空響應

圖7

通過WGCNA分析，作者還發現另一個高表達AD相關少突膠質細胞基因的模塊OLIG，為了探究這個模塊與Aβ累積的關係，作者從AD症小鼠中分離出Aβ累積的區域，發現3月時OLIG的表達與Aβ累積呈正相關，18月時呈負相關（Fig7A-B），且不同腦區也有所差異，如在纖維束(FB)、丘腦(TH)和下丘腦(HY)中存在顯著的正相關，而在內嗅皮層（ENTI）中則存在顯著的負相關（Fig7C-F）。最終作者證實，在輕度Aβ累積下，OLIG模塊高表達，但在高密度Aβ積累下，OLIG表達減少。

8. 人腦中PIG和OLIG的可視化

圖8

為了驗證前面的發現，作者將PIG和OLIG的基因，與RNA-seq數據發現的人AD相關基因做交互分析，發現PIG中的45個基因，OLIG的42個基因與AD相關基因重疊。與預期的一樣，PIG模塊和OLIG模塊基因分別在灰質和白質中被富集（Fig8A-B）。與ISS分析類似，作者分析PIG基因在AD患者和control中的表達，發現與對照相比APOE和ARPC1B在AD患者的小膠質細胞中顯著表達，NPC2、S100A6、ITGB5、PRDX6和VSIR在AD患者星形膠質細胞中顯著表達，提示AD患者疾病相關的膠質細胞激活（Fig8D）。此外，在OLIG中發現22個基因在Aβ累積部位中顯著缺失（Fig8）。

研究結論

本文利用空間轉錄組學研究了在AD小鼠模型中，澱粉樣斑塊周圍直徑為100mm的組織域中發生的轉錄變化。發現了富含髓鞘和少突膠質細胞基因（OLIGs）的基因共表達網絡的早期改變，而斑塊誘導的基因（PIGs）的多細胞基因共表達網絡涉及補體系統、氧化應激、溶酶體和炎症，在疾病的後期非常突出。此外作者通過對小鼠和人腦切片進行原位測序（ISS），證實了大多數觀察到的細胞水平的變化。空間轉錄組學分析為探究AD和其他腦部疾病致病特徵附近失調的細胞網絡提供了可能。

參考文獻

Chen WT, Lu A, Craessaerts K, et al. Spatial Transcriptomics and In Situ Sequencing to Study Alzheimer's Disease. Cell. 2020;182(4):976-991.e19. doi:10.1016/j.cell.2020.06.038

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