MicroRNA（miRNA）是一類的小的內源非編碼RNA，在植物和動物的基因組中普遍存在。其異常表達與多種人類疾病密切相關，因此miRNA被認為是臨床上有價值的潛在診斷和預後生物標誌物，也是藥物和基因治療的有希望的靶標。所以對microRNA進行靈敏和選擇性地檢測，特別是具有高空間解析度的特定miRNA，對其亞細胞定位和分布的原位可視化對於理解miRNA的生物學功能，發現藥物靶標和個性化治療非常有價值。但是由於miRNA很小且豐度低，準確分析與癌症相關的miRNA仍然具有挑戰性。
最近，福州大學吳再生課題組在ACS Nano上發表了一篇題為「Intracellular Nonenzymatic In Situ Growth of Three-Dimensional DNA Nanostructures for Imaging Specific Biomolecules in Living Cells」的研究論文。該課題組開發了一種3D的DNA納米結構的非酶回文催化的組件（NEPA）。通過將相同的三個回文片段分別引入三個髮夾式探針中，催化Y形DNA的形成以及隨後的維持裝配高階結構。基於NEPA的策略可以實現3D納米Y-DNA球形結構（NS）的原位指數增長，以響應癌細胞中的內源性刺激，從而實現了通過化學修飾髮夾探針來對細胞內miRNA進行原位螢光成像。這種方法可以檢測到低至1.4 pM的靶標miRNA，並對其家族成員的區分可達到接近100％的準確度。基於NEPA的傳感策略也適用於癌症相關蛋白受體的細胞內原位螢光成像，可為開發傳感提供有價值的借鑑，從而加深對重要生物分子在疾病發病機理和未來治療應用中的生物學功能的了解。
原理圖. 觸發探針（TP）引發的NEPA原位合成3D DNA納米結構的示意圖。DNA構建塊組件HA，HB和HC被設計為彼此部分互補，並且在3'端具有相同的迴文序列，因此易於組裝成Y-DNA單元，每個單元均具有基於回文的三個粘性末端，然後通過回文粘性末端的雜交形成高級的DNA超結構。在TP刺激下，自主NEPA組裝以高度有序、回文依賴的方式發生，該方式可分為四個階段。第一階段：TP通過打開HA的莖環結構促進的鏈之間迴文序列的雜交反應。第二階段：開放的HA與HB雜交，生成TP / HA / HB依賴性的三鏈體或多重結構，具有更多活性的粘性末端，這些粘性末端可以彼此相互作用並穩定過渡態中間體。第三階段：HB可以與HC雜交，並藉助開放的PF的回文粘性末端促進HC與HA的雜交，從而導致TP移位並形成Y形HA / HB / HC三元組。釋放的TP能夠與另一個HA雜交並啟動下一輪組裝反應。階段IV：通過回文粘性末端的雜交，大量的Y-DNA被交聯。
圖1. （a）基於NEPA檢測miR-21的方法示意圖。（b）PAGE驗證基於NEPA的系統用於miR-21檢測的可行性。第1、2、3和4泳道中的表示存在TH，HA，HB和HC。在沒有靶標miR-21D的情況下，泳道5中的單條帶表明四個髮夾探針可以通過莖有效地自鎖，並且不會發生分子間雜交。在泳道9中觀察到了凝膠條帶有實質性變化，包括非常少量的殘留DNA髮夾和出現了具有極低凝膠遷移率的最高條帶，這證明了具有高分子量的NEPA組裝產品的形成。（c）700 nm×700 nm視野中的AFM圖像，說明自組裝的產物是納米級球形結構，其直徑為148±14納米。比例尺為140 nm。（d）螢光測量證明基於NEPA的系統用於miR-21檢測的可行性。對於不存在目標miR-21D的空白樣品（樣品5），未觀察到可檢測到的螢光變化，表明未發生基於NEPA的信號傳導過程。而即使添加的靶標miR-21D濃度（25 nM）比靶標識別的TH濃度（100 nM）低得多，基於NEPA的系統也會發出非常高的螢光信號，從而有很高的螢光（樣品1），達到約9倍的信噪比。（e）基於NEPA的系統檢測miR-21的特異性。
圖2. a）基於NEPA組裝的DNA納米球原位合成示意圖，用於活細胞內miR-21成像。（b）MCF-7細胞（第I組），有明顯的綠色和紅色螢光。而雌二醇（E2）中基於NEPA的miRNA-21成像處理的MCF-7細胞（II組），螢光明顯減弱，這是因為E2抑制了miR-21的表達。當抗miR-21D（與microRNA-21互補）共轉染到MCF-7細胞中時（III組），活細胞中miR-21與TH-FAM和抗miR-21D之間的競爭會損害NEPA組裝的效率，螢光強度明顯降低，證實DNA納米結構的形成。無觸發髮夾TH的MCF-7細胞（IV組）和L-02細胞為陰性對照（V組）。比例尺：10μm。（c）圖（b）中描述的相應細胞的流式細胞儀定量，實驗結果與螢光成像結果吻合。藍色峰表示細胞，紅色峰表示NEPA產物。（d）通過NEPA（上半部分）和FISH（下半部分）技術對MCF-7細胞進行圖示（左圖）和共聚焦螢光圖像（右圖）。結果表明NEPA系統有明顯的綠色或紅色螢光信號。尤其是，來自「 Cy5」圖像和相應「 CCFI」圖像的螢光信號遠高於通過FISH方法測得的信號。此外，「合併」圖像中的黃色斑點表明TH-FAM探針的綠色螢光信號與HC-Cy5摻入的DNA NS結構產生的紅色螢光重疊良好，從而證實了T雜交和NEPA組裝之間的共定位。比例尺：10 μm。（e）僅對MCF-7細胞，FISH探針處理過的細胞和NEPA探針處理過的MCF-7細胞進行流式細胞分析。驗證了優於傳統FISH方法的NEPA系統理想的螢光成像能力，從而驗證了對靶miRNA的細胞內成像的敏感性大大提高。（f）通過計數至少10,000個細胞，從（e）中描述的相應MCF-7細胞記錄的螢光。CCFI指示顏色編碼的螢光強度。
圖3. （a）HeLa細胞中形成的NEPA產物的隨時間延長的研究。紅點代表帶有Cy5標記探針的DNA納米球。合併的圖像表示與基於DIC顯微鏡的圖像合併的螢光圖像。（b）在給定區域中在（a）面板中標記的放大的紅點。儘管區域1、2和3中的螢光強度互不相同，但是隨著孵育時間的增加，整個區域中的螢光強度逐漸增加，這表明DNA NS納米結構逐漸生長。區域1、2和3的比例分別為5.0×5.0 μm，6.0×6.0 μm和5.0×5.0 μm。（c）孵育時間依賴性螢光強度（圖a）的整個區域及其局部區域如圖（b）所示。（d）通過NEPA探針處理的MCF-7細胞的Z-堆疊圖像。在「合併」面板中，每個面板上都有明顯不同大小的黃色或橙色螢光點Z軸平面。此外，FAM和Cy5的螢光峰絕大多數出現在同一位置，而MOC的最小值（0.833）仍遠高於文獻報導的0.6，表示在任何Z軸平面上幾乎完全共定位。。這些光學測量表明，在內源性生物分子的特定刺激下，3D DNA納米結構的非酶原位自主生長可以在活細胞的複雜內部環境中有效地進行。Cy5和FAM的螢光強度通過ImageJ軟體估算。比例尺為10μm。MOC表示曼德斯重疊係數，用於量化兩個螢光信號的共定位程度。
總之，作者提出了一種非酶回文催化的完全自主細胞內級聯反應的組裝方法，這種方法不需要任何組裝中間體和非核酸輔助材料，完全由原始DNA髮夾結構單元完成的，以響應極其複雜的細胞內環境中的內源性刺激，並在原位產生3D納米級DNA球形體系結構。通過在NEPA組裝過程中測量螢光團偶聯的DNA髮夾結構的螢光變化，可以將感興趣的患病生物標記物在活細胞中進行原位成像。在實時共聚焦螢光成像的時間尺度和空間解析度下監測NS納米結構的細胞內分布和動態變化。利用NEPA系統，可以高靈敏和特異地對細胞內靶標miRNA進行成像，準確檢測出相同或不同細胞系中miRNA的不同表達水平。因此，能夠容易地區分健康細胞和癌細胞，甚至不同的癌細胞系。此外，由於觸發探針具有突出的序列可編程性，因此僅通過更改其序列即可通過引入合適的適體配體，NEPA系統能夠用於其他內源性靶標（例如細胞膜表面蛋白）的成像分析。基於NEPA的系統提供了一種具有高空間解析度的實時監控工具，用於在活細胞中超敏感地原位觀察miRNA和蛋白質表達，為基礎生物學研究和生物醫學診斷開闢了道路。
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.9b09995
吳再生，福州大學閩江學者特聘教授，化學學院教授、博導。於惡性腫瘤等重大疾病分子診斷、核酸適體構型轉換探針、核酸砌合納米器件與G-四股螺旋核酸探針生化檢測體系等領域取得多項具有國際先進水平的研究成果；在Nature Communications （IF=10.7），Biomaterials （IF=8.3），Analytical Chemistry （IF=5.8），Nucleic Acids Research （IF=8.8）與Chemical Communications （IF=6.7）等刊物發表學術論文近60篇。（曾）主持國家自科青年-面上連續資助項目基金或其它項目基金8項；是重大研究計劃重點項目等7項國家自科基金項目重要參與人、國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）及重大科學研究計劃項目實質承擔人。
教育工作經歷：
2002年-2008年，湖南大學分析化學博士；
2006年-2012年，湖南大學化學生物傳感與計量學國家重點實驗室固定成員；
2010年-2013年，加拿大麥克馬斯特大學Michael G.DeGroote 國際人才重點專項基金博士後研究員；
2013年-2014年，加拿大麥克馬斯特大學生物化學與生物醫學系博士後研究員；
2014年-至今，福州大學化學學院閩江學者特聘教授。
研究方向：化學生物傳感；功能化核酸；核酸納米器件；生物化學納米技術。
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