2019/01/11作者/EWG1990儀器學習網
液相色譜法作為一種重要的分離分析手段，具有能通過色譜柱分離複雜樣品中不組分的能力，這種能力是任何其他分析方法所無法比擬的。對色譜柱分離後的組分進行。儘管液相色譜法包多定性及定量鑑定，是色譜工作者完成分析工作的一個重要環節。儘管液相色譜法包括多種模式，但無論採用何種模式，對樣品進行定性及定量分析皆基於通過檢測器得到的圖信息。
液相色譜過程中影響溶質遷移的因素較多，同一組分在不同色譜條件下的保留值可能相差很大。即便在相同的操作條件下，同一組分在不同色譜柱上的保留也可能有很大差別。在同根色譜柱上的分離，有時甚至會因為流動相組成的改變而出現出峰次序顛倒的現象。顯然，與氣相色譜相比，液相色譜法定性的難度更大。對液相色譜中組分定性方法的研究一直是色譜工作者努力探求的一項重要工作。這裡只介紹幾種最常用的定性方法。
一、利用已知標準樣品定性
在具有已知標準物質的情況下，利用標準樣品對未知化合物定性是最常用的液相色譜定性方法，這也是唯一在任何條件下都有效的方法。當無標準物時，其他定性方法才被推薦採用。
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液相色譜的分離機理比較複雜，除了吸附和分配機理外，還有離子交換、體積排除、親和作用未知物疏水作用等分離機理。組分的保留行為不僅與固定相有關，還與流動相的種類及組成有關。因此，利用該法定性的依據是：在相同的色譜操作條件下（包括柱長，固定相、流動相等），組分有固定的色譜保留值。即在同一根色譜柱上，用相同的色譜操作條件分析未知物與標準物已知標準物，通過比較它們的色譜圖，對未知物進行比較鑑別。當未知峰的保留值與某一已知標準物完全相同時，可以初步判斷未知峰與該標準物是同一物質；在色譜柱改變或流動相組成經多次改變後，被測物的保留值與已知標準物的保留值仍能相一致，能夠進一步證明被測物與標準物是同一物質。（如圖1所示）
圖1 醇溶液定性分析色譜圖
已知標準物：A-甲醇；B-乙醇；C-正丙醇；
D-正丁醇；E-正戊醇
二、利用檢測器的選擇性定性
各種不同的液相色譜檢測器均有其獨特的性能。示差折光檢測器是一種通用性的檢測器，但是靈敏度一般較低；紫外、螢光及電化學檢測器為選擇性檢測器，靈敏度相對比較高。擇性檢測器只對某類或某幾類化合物有響應可以藉此對特定化合物進行定性分析。在相色進條件下，同一樣品在不同檢測器上有不同的響應信號，亦可結合幾種選擇性檢測器的測試結果對其定性。
樣品經色譜柱分離後進入並聯或串聯的幾種（兩種或兩種以上）檢測器，根據其響應情可以初步判別未知化合物的具體類別。以烴類及其衍生物為例，在紫外光譜區（190～400nm）飽和烷烴的響應很小；而以共軛雙鍵結合的分子如芳香烴等則有較強的響應，分子中環的數量越多，響應越強。對於包含幾種烴類組分的混合物樣品，將色譜柱中的流出物時引入並聯的兩種檢測器，或按順序依次引入串聯的兩種檢測器，可以得到兩張色譜圖，對比各組分在不同譜圖上的相對峰高可初步判別組分所屬化合物的類型。
在實際分析中多採用雙檢測器定性。同一檢測器對不同種類化合物的響應值有所不同，而不同檢測器對同一化合物的響應也不相同。當某一被測化合物同時被兩種或兩種以上檢測檢測時，兩個檢測器或幾個檢測器對被測化合物檢測靈敏度比值與被測化合物的結構性質密切相關，可以用來對被測化合物進行定性分析，這就是雙檢測器體系的原理。
觀檢測器體系的連接方式可採用串聯連接和並聯連接兩種方式。當兩種檢測器中的一種是非破壞性檢測器（如TCD）時，可採用簡單的串聯連接，將非破壞性檢測器串接在破壞性測器之前。此時要注意兩個檢測器的出峰時間差。若兩種檢測器都是破壞性的，則需採用並聯方式連接。在色譜柱的出口端連接一個三通，然後分別連接到兩個檢測器上。連接後的兩臺檢測器同時進行數據採集，對照所得到的兩張色譜圖可進行定性。
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圖2為三組分樣品經色譜柱分離後分別在並聯的紫外和示差折光檢測器上得到的色譜，比較圖2中（a）和（b），可以對樣品中的三個組分的類別作出初步判定。相對而言，峰1在紫外檢測器上的響應較高，峰2和峰3的響應則很弱，初步判斷組分1可能帶有苯環。而組分2和組分3不大可能帶有芳環。總之比較各組分在不同檢測器上的色譜圖相對響應值，有可能粗略地推測某一類化合物是否存在。
圖2 雙檢測器定性
（a）UV；（b）RI
固定相： Nucleosil-CN
流動相：10mmol/L乙酸水溶液＋0.18mmol/L
N-二甲基普羅替林
溶質：1一辛胺；2一辛磺酸；3一辛硫酸
紫外檢測波長：292m
三、利用DAD三維圖譜檢測器定性
光電二極體陣列檢測器（DAD）可以對色譜峰進行光譜掃描。在進行未知組分與已知標準物質比對時，除了比較未知組分與已知標準物質的保留時間外，還可比較兩者的紫外光譜圖。如果保留時間一樣，兩者的紫外光譜圖也完全一樣，則可基本上認定兩者是同一物質；若保留時間雖一樣，但兩者的紫外光譜圖有較大差別，則兩者不是同一物質。這種利用三維圖譜比較對照的方法大大提高了保留值比較定性方法的準確性。傳統的方法是：在色譜圖上某組分的色譜峰極大值出現時，即最高濃度譜帶進入檢測器時，通過停泵等手段，使組分檢測池中滯留，然後對檢測器中的組分進行全波長（180～800nm）掃描，得到該組分的外可見光譜圖取可能的標準樣品按同樣方法處理，對比兩者光譜圖即能鑑別該組分是否與，也可以通過對照標準譜圖的方法來識別來標準品相同。對某些有特徵紫外光譜圖的化合物，也可以通過對照標準譜圖的方法來識別未知化合物（如圖3）。
圖3 丹皮酚標準品和六味地黃丸的三維色譜圖
DAD不僅可以得到樣品色譜圖，還可以得到樣品的時間-檢測波長-色譜信號的三維過樣品的光譜圖，可以很方便地觀察到不同出峰時間段內組分的紫外（或紫外-可見）區光譜圖，通過樣品的光譜圖也可以進行樣品鑑別，對液相色譜定性具有更大的優勢。圖4是一組化合物的色譜光譜圖，圖5是對應的光譜圖。通過對比色譜峰上各點的光譜圖可以判別峰的純度，而與標準品的紫外光譜圖或標準譜圖相比較，也可以進一步確認未知化合物的結構。
圖4 10種頭孢類抗生素混合物的三維色譜圖
1一頭孢；2一頭孢米諾；3一頭孢他；4一頭孢唑肟
5一頭孢克洛；6一頭孢氨苄；7一頭孢曲松；
8一頭孢拉定；9—頭孢呋辛；10—頭孢唑啉
圖5 10種頭孢類抗生素的光譜圖
註：圖中標記1~10同圖4
實際上，當樣品中的不同化合物具有相同的UV生色團時，DAD的定性功能很有限。且當流動相或其他因素改變時也會對DAD的峰定性產生一定的影響。
四、利用保留值規律定性
與氣相色譜相比，液相色譜中組分的保留行為也不僅只與固定相有關，還與流動相的種類及組成有關，為了使樣品中的多種溶質組分得到更好的分離，可以通過改變流動相組成等手段實現。相應地，亦可以根據某一化合物在特定條件下的保留值變化規律來推測其結構特性。在液相色譜中，溶質保留值變化規律一般受3個或3個以上因素的協同制約，從而給這種提供定性信息方法的實踐帶來很大困難。
對通過流動相組成與化合物保留值之間關係的理論研究，一些在局部範圍內有參考應用價值的經驗關係式已經被得到，可以在一定程度上用於樣品的定性。
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1.反相色譜中的a、c指數定性
理論研究表明，在以鍵合矽膠為固定相的反相色譜中，溶質保留值與流動相組成關係式中的係數能夠反映溶質的結構特徵，因此可用於對溶質的輔助定性。液相色譜中存在如下規律：
（1）
其中，a、c為常數，φB為強溶劑的體積分數。
對非極性、同系物或極性相似、氫鍵作用能相似的組分，a、c之間有很好的線性關係：
（2）
其中：
式中，I1、I2、I3、I4是與色譜柱以及流動相種類有關的常數；m1、m2、m3、m4是與流動相有關的常數；X為相互作用能；μA為組分的偶極矩。
採用一個化合物校正後，即可從作用指數c計算出a，並由式
計算出容量因子。所以建立一個指數c的資料庫就可以對非極性或同系物進行保留值預測及定性。
對於同種類型的鍵合均勻的C18固定相，當組分與固定相作用不發生氫鍵變化以及構象變化時，各C18柱熱力學上的差別主要反映在固定相C18的鍵合量、比表面積以及柱相比上。同一種化合物在兩支不同色譜柱上的參數a有簡單的線性關係：
（3）
不同極性取代基化合物的定性需同時建立a、c雙參數資料庫，在作用指數的基礎上，將保留指數換算為參數a，再利用式（3）定性。
採用作用指數定性時，可先選幾個標準物來標定柱系統，獲得式（3）的線性關係。盧佩章等給出了460種化合物在C18柱上不同條件下的參數a、c，並提出了不同柱系統，大同衝洗劑濃度組成時參數a、c之間的換算方法。在相同的色譜條件下，如果樣品中某一組分的a、c值與一已知標樣相同，即可認定兩者為同一種化合物。
2.有機酸鹼的pH-pKa規律定性
在反相液相色譜系統中，改變流動相pH值，不同種類的可解離有機酸、鹼等樣品的保留值變化有其獨特的規律，如圖6所示。
對一類有機酸組分而言，在特定的條件下其解離常數pKa本不變，流動相中pH值變化後，對有機酸的解離起到調節作用，因此溶質的容量因子也將隨之變化。對於有機鹼類的溶質，容量因子隨流動相pH值的變化與有機酸正相反。因此，對一個未知化合物而言，測定其容量因子隨流動相pH值的變化規律，即能判斷其為有機酸類或有機鹼類化合物，以及其酸、鹼性的強弱。
圖6 一元有機酸（實線）、鹼（虛線）的容量因子與流動相pH-pKa關係
3.碳數規律定性
利用碳數規律定性，可以在已知同系物中幾個組分保留值情況下，推出同系物中其他組分的保留值，然後與未知物的色譜圖進行對比分析。
容量因子（k'）是溶質的一種結構型物性參量，其對數值與同系物碳數之間存在良好的線性關係：
（4）
其中，a、b為常數，n為同系物碳數。
對於包含有同系物組分的樣品，已知部分同系物在色譜圖中位置的情況下，可以根據碳數規律推出同系物中其他組分的保留值，並對同系物的未知部分進行定性。
利用碳數規律定性時，應先判斷未知物類型，才能尋找適當的同系物。與此同時，要注意當碳原子數較小或較大時，可能與線性關係發生偏差。
這一規律適用於任何同系物，如有機化合物中含有的矽、硫、氮、氧等元素的原子數及某些重複結構單元（如苯環、C＝C、亞氨基等）的數目均與溶質容量因子的對數呈線性關係，同樣適用於上述規律。
五、聯用技術結合定性
色譜法具有很高的分離效能，但它不便於對已分離的組分直接定性。而紅外光譜、質譜、核磁共振等是剖析有機物結構的強有力工具，特別適用於對單一組分定性，但是它們對混合物無能為力。將色譜儀與定性分析的儀器聯用，則可以取長補短，解決組成複雜的混合物的定性問題。隨著計算機技術的發展及應用，色譜聯用技術得到了很好的發展。
近年來，液相色譜與其他分析方法的聯用技術得到較大的發展，曾經需要離線完成的定性工作可以很便利地在線解決。高效液相色譜質譜聯用技術為樣品特別是生物大分子的定性分析提供了一種強有力的手段，它能準確測得未知物分子量，是目前解決複雜未知物定性分析的最有效工具之一；高效液相色譜-核磁共振聯用技術是有機化合物結構分析的強有力的工具，特別是對同分異構體的分析十分有用高效液相色譜紅外光譜聯用技術在有機化合物的結構分析中有著很重要的作用，可用於對官能團定性；色譜原子光譜（原子吸收光譜和原子發射光譜）聯用技術主要用於金屬或非金屬元素的定性、定量。關於聯用技術的應用，最近已有相關專著問世，可供參考。
1.與紅外光譜儀聯用
紅外光譜是一種強有力的結構鑑定手段，幾乎沒有兩種物質有完全相同的紅外光譜。20世紀80年代後，傅立葉變換紅外技術得到迅速發展。傅立葉變換紅外光譜儀（FTIR）具有測量快速（0.2s）、靈敏度高（納克級）的特點能夠在得到色譜圖的同時監測每個色譜峰的完整光譜。
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與HPLC聯用的傅立葉聯用光譜儀有兩種類型，一類不必除去流動相，儀器的數據處理系統能夠通過差減的方式扣除溶劑的紅外吸收光譜，得到被測物的紅外光譜。由於流動相組成通常不是單一的，且各組分含量不定，所以光譜差減較困難。一般只適用於正相色譜，對於反相色譜，需要採用細內徑柱和氘代溶劑。另一類需除去溶劑後進行檢測，已有的接口包括漫反射轉盤接口、緩衝存儲接口和粒子束接口等。各種接口有其適用範圍和限制。總之，傅立葉變換紅外光譜儀在提高靈敏度、記錄光譜等方面的改進，可使它用於普通HPLC分析物的檢測，但聯用技術特別是接口技術尚有較大的改進空間。
2.與核磁共振的聯用
與其他HPLC檢測器相比，核磁共振（NMR）是一種信息豐富的檢測手段，其化學位移和偶合常數能提供豐富的有關分子中每個氫原子的局部電子環境的結構信息。在有機結構分析四大譜（紅外光譜、紫外光譜、核磁共振、質譜）中，NMR是最好的一種推斷化合物結構的手段。HPLC與NMR聯用的有利條件是：HPLC與NM都是在溶液狀態下操作，無需揮發和加熱步驟。核磁共振對樣品是非破壞性的，為實現HPLC-NMR-MS三聯用和HPLC-NMR-FTIR-MS四聯用提供了可能性。
LC-NMR聯用技術在20世紀80年代初期已經開始研究，但是由於NMR靈敏度低（10-4~10-5g），液相色譜使用的氘代溶劑十分昂貴和溶劑信號對樣品的千擾等技術上的原因，聯用技術發展緩慢。近年來，NMR技術迅猛發展，磁場強度不斷提高，氘鎖通道性能改善，可以不用或少用氘代試劑，在抑制溶劑峰方面也有很大進展，設計方面已有專為LC-NMR聯用的流動液槽探頭。LC-NMR聯用主要有三種模式：連續流動模式、停止流動模式和峰存儲模式，也有多種接口可供選擇。
3.與原子吸收光譜儀的聯用
HPLC能分離各種各樣的有機或無機金屬化合物的樣品，原子吸收光譜（AAS）儀對大多數元素能做選擇性的、高靈敏度的檢測。HPLC和AAS的聯機使用，在環境和生物化學研究中已得到應用。
HPLC柱流出物是溶液，而AAS測定所用樣品也為液體，因此HPLC與AAS的聯機較為方便，一般認為只需將HPLC流出液引入原子化器即可。但困難是HPLC柱流出液的流速（0.5～2ml/min）和樣品溶液引入AAS儀的流速（2～10ml/min）不匹配，一般而言，一滴液滴（100μl）可滿足AAS的分析要求，因此採用人工調節使兩者匹配很困難。一種分析小量樣品的原子吸收注入方法已經被發展。用液滴形成器收集HPLC流出物，產生的小液滴落入漏鬥中，然後被吸入火焰，實現AAS分析。
4.與原子發射光譜儀的聯用
許多元素受到適當的激發時會發射特徵波長的輻射，可採用原子發射光譜（AES）儀進行測定。同AAS比較，AES能夠同時進行多元素測量，適合於在線監測HPLC柱流出物。
AES分析溫度大大高於AAS分析同種元素時所需要的溫度，這是因為在AES中要使原子激發，而在AAS中僅是原子的氣化。AES常用的激發原子的方法包括火焰法和電感耦合等離子體法，二者都已用於HPLC-AAS聯用儀器系統。相比之下，電感耦合等離子體AES（ICPAES）比火焰AES（FAES）的靈敏度更高。
ICPAES用作HPLC檢測器對多數金屬離子的檢測限達到10-9～10-10g/ml雖然與HPLC-FAES相比，HPLC-ICPAES法具有更高的靈敏度和選擇性，但其成本卻高得多。AES用於許多物質的測定，如螯合物中的銅，有機金屬配合物中的金屬，磷酸鹽中的磷，生物樣品中的砷、蛋白質、核糖核酸、硒等。
HPLC-ICP藉口連接的主要問題是典型的LC流動相流速不適於等離子體源。這種專屬的原子發射光譜檢測器一般使用在線霧化激發小體積（5~200μl）液體，液體轉化成氣溶膠後引入原子激發池，使用一種全注入微濃噴霧器，有助於提高較低的霧化和遷移效率減小等離子體焰炬、水冷噴霧室、採用低壓和低流炬、氧摻雜等方法也可以提高轉化效率。
5.與電子自旋共振光譜儀的聯用
除了紅外光譜區，電磁輻射的微波光譜區也已經被開發使用，成為（一種有用的檢測器。電子自旋共振光譜（ESR）可以滿足HPLC對檢測器的許多要求，如檢測限、選擇性、溶可溶性等，但目前應用不多。
ESR的研究對象是至少具有一個未成對電子的原子或分子。分子中的未成對電子在直流磁場作用下產生能級分裂，當施加在垂直於磁場方向上的電磁波滿足一定條件時，處於低能級的電子吸收電磁波能量躍遷到高能級，產生電子順磁共振現象。吸收信號的一次微分譜圖反映樣品的結構信息，對吸收曲線進行積分，可測得順磁物質的自旋濃度，從而實現對樣品進行定性、定量分析。
為了獲取ESR光譜，樣品被放在強磁場區，用微波激發。在0.34T（3400G）磁場區，共振所需頻率為9.5×109Hz，最小可測量10～13mol未成對電子，這使ESR可能成為一個最靈敏的檢測器。HPLC與ESR的連接無需特殊的接口。
用60Co放射源的強γ射線激發生物分子如胺基酸、核酸，能獲得樣品的ESR譜，但由於混合物樣品的譜圖重疊，需要在樣品結構測定前進行HPLC分離。其缺點是許多自由基的生命周期太短而不能實現分離，為此可以使用各種自旋捕捉試劑來提高自由基的生命周期。在HPLC-ESR的聯用分析中，除了可以獲得樣品濃度信息外，還可以通過停流獲得樣品的ESR譜，得到未成對電子的化學環境信息。ESR作為HPLC的檢測器，具有很高的選擇性，特別是對不同氧化態的金屬的分析；缺點是ESR的靈敏度不夠高，且價格昂貴。
利用金屬元素與自旋標記試劑反應形成配合物，通過測定配體的ESR信號，而不是金屬元素的順磁性，也可以進行多元素的分析。
6.與表面增強拉曼光譜儀的聯用
當一束單色光照射到樣品上後，樣品分子使入射光發生散射。在散射光譜中出現頻率為幾個波數到幾千個波數的散射光為拉曼散射。不同的分子或結構有特徵的拉曼位移，拉曼光譜線的強度與入射光的強度和樣品分子的濃度成正比，據此可以對樣品分子定性、定量分析。目前的拉曼光譜一般都採用雷射激發，雖然雷射使拉曼效應增強了，但拉曼散射仍比較弱，而表面增強拉曼散射（SERS）可以使拉曼散射截面增加5～6個數量級，具有較高的靈敏度，有利於滿足痕量分析檢測的需要。SERS已經成為檢測藥物、生物醫學和環境等領域痕量有機化合物的高靈敏度、高選擇性和靈活性的一項技術。
許多分子都能產生拉曼散射，但SERS效應只有在少數金屬（Ag、Au、Cu、Li、Na、K等）表面上才能出現，其中銀的表面增強效果最佳。為了使金屬表面達到能產生SERS效應的粗糙度，可以採用多種處理辦法，其中採用銀金的膠體溶液有較好的效果。但膠體溶液具有凝絮趨向，會導致結果重現性差；而流動系統，如流動注射技術和高效液相色譜，有助於減少凝絮趨向。近年來，採用銀的膠體溶液的SERS在HPLC中的應用逐漸發展。研究結果表明，較高的溫度會加大膠體凝集，增強拉曼信號，這不但可以得到通常的二維色譜圖（時間-SERS強度），而且能獲得三維圖譜（時間拉曼位移-SERS強度），為定性分析提供更多的依據。
檢測器使用普通的流通池時，每次都需要用稀硝酸清洗整個系統，以去除銀的膠體溶液和其他物質在管壁的沉積。這些沉積物具有較強的記憶效應，會產生色譜峰的拖尾、基線漂移、譜圖幹擾等。為此，有人提出了一種無窗流通池的設計，柱後流出液與Ag的膠體溶液混合後進行檢測，效果較好。
六、化學方法定性
化學方法定性就是利用化學反應，使樣品中某些化合物與特定試劑發生反應，生成相應的衍生物，常用的方法有柱前預處理、柱上選擇除去和柱後衍生三種。
1.柱前預處理法
這是使用物理或化學消除劑將樣品中某類化合物消除、減少或轉化，從而得知樣品中是否含有這類官能團化合物的方法。操作時將給定的消除劑塗在載體上或直接放在消除柱中，或放在進樣的注射器中，當樣品與消除劑接觸後，消除劑迅速使這類化合物發生不可逆吸附減化學反應，而使其色譜峰消失、變小或發生位移，通過比較色譜圖，可以判定樣品中有無這類官能團化合物的存在。
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使用這種方法時可直接在色譜系統中裝上預處理柱，如果反應過程進行較慢或進行複雜的試探性分析，也可使試樣與試劑在注射器內或者其他小容器內反應，再將反應後的試樣注入色譜柱。
2.柱上選擇除去法
與柱前預處理法的原理相同，將某些有特徵性吸附的吸附劑裝入一個短柱內，或將某些化學試劑塗到一些載體上，再裝入一個短柱內，將該短柱（稱為預柱）串聯在分析柱前，使樣品中某些組分在通過預柱時被吸附或與這些特徵化學試劑發生化學反應而被吸附，從而使這些組分不能進入分析柱被分析，在色譜圖上與這些組分相對應的色譜峰將消失。
3.柱後流出物化學反應定性法
將色譜分離後的組分直接通入到某些特徵試劑中，或將柱後流出物收集後再加入特徵試劑，觀察這些組分與特徵試劑發生化學反應後的某些變化，如顏色變化、沉澱出現，有氣體放出或其他明顯變化，即可對未知組分的類型作出初步鑑定。
用柱後流出物化學反應定性時，使用的檢測器應為非破壞性檢測器，即樣品在檢測器內不能發生化學反應。
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