來源：www.bioon.com 2006-12-17 01:33
摘要:採用高效液相色譜-二極體陣列檢測器聯用儀(HPLC-DAD)對中藥枸杞的甜菜鹼、類胡蘿蔔素提取液進行了指紋圖譜研究。研究結果表明:用於枸杞質量控制的液相色譜指紋圖譜對提取方法具有很強的依賴性,用枸杞甜菜鹼提取液的液相色譜指紋圖譜對品種進行識別效果較好,而採用類胡蘿蔔素提取液的液相色譜指紋圖譜有利於枸杞真偽的識別和共有模式的建立;此外,還提供了甜菜鹼和類胡蘿蔔素的紫外光譜,為定性分析以及不同樣本中峰的識別提供了一定的依據。
關鍵詞:枸杞;高效液相色譜;甜菜鹼;類胡蘿蔔素;指紋圖譜
枸杞( Fruct us Lycii) 作為傳統名貴中藥材,在國內乃至全世界範圍內得到了相當廣泛的應用。現代藥理學研究認為,枸杞具有提高機體免疫、抗突變、抗衰老、抗腫瘤、抗疲勞、明目以及降低血脂和膽固醇等功能。枸杞種屬70～80 種,如何對其進行分辨選擇,還沒有一種科學的方法。孫素琴等將枸杞優劣的原性狀鑑別大體上歸納為4點,但是用這種原性狀鑑別枸杞子優劣的方法容易受主觀影響。現在有研究者用DNA技術、細胞形態學以及紅外光譜等方法來對種屬進行分辨,但這些技術尚不成熟。
目前,人們對中藥的質量控制大多是對中藥諸多組分中的某個有效成分或指標性成分進行定性、定量分析,但採用這種方法並不能全面地反映中藥的質量。而中藥指紋圖譜是對某種中藥材或中成藥經適當處理後,採用一定的分析手段,得到能夠標示該中藥材或中成藥特性的色譜或光譜的圖譜。中藥指紋圖譜有2個特點:一是通過指紋圖譜的特徵性, 能有效鑑別樣品的真偽或產地;二是通過指紋圖譜主要特徵峰的面積或比例的確定,能有效控制產品的質量,確保產品質量的相對一致。目前,指紋圖譜已成為國際公認的控制中藥或天然藥物質量的最有效手段。在此,作者以枸杞的主要活性成分中的類胡蘿蔔素、甜菜鹼的提取液為基礎對枸杞的化學指紋圖譜進行探討。
1 實 驗
1. 1 儀器與試劑
主要儀器有:Agilent 1100HPLC-DAD系統,含在線真空脫氣機、高壓梯度泵、二極體陣列檢測器(DAD) ,HP Chemstation 色譜工作站。主要試劑有: 乙腈(色譜純) ; 二氯甲烷(色譜純) ;甲醇、四氫呋喃、石油醚和碳酸鎂(均為分析純) ;枸杞樣本1(L Chinense Mill ,我國主要的野生種,日本藥典將其規定為正品枸杞)與枸杞樣本2(Lycium barbarum L ,我國主要生產栽培種,中國藥典2000 年版第1 部規定其為正品枸杞) ,由香港浸會大學提供;枸杞樣本3是銀川新城區企業公司土特產分部的枸杞。
1. 2 試樣製備
1. 2. 1 甜菜鹼提取液的製備
甜菜鹼的提取方法見文獻,取0.2g 幹枸杞碾碎,加入20mL甲醇,在室溫下超聲振蕩30min,以3000r/min的速度離心3min,將殘渣用甲醇重複提取3次。減壓濃縮, 水溶解定容。過0.45μm微孔濾膜,作為枸杞的甜菜鹼提取液供試品。
1. 2. 2 類胡蘿蔔素提取液的製備
類胡蘿蔔素的提取方法見文獻,取10.0g乾燥枸杞與1.0g碳酸鎂一起粉碎,加入50mL四氫呋喃和甲醇混合液(體積比為1∶1) ,超聲振蕩15min ,以3000r/min 的速度離心6min,加入50mL 石油醚(沸程30～60℃)和50mL飽和氯化鈉溶液,靜置分層,再用石油醚重複萃取2次,收集上層溶液,在35℃減壓乾燥,最後用二氯甲烷溶解定容。過0.45μm 微孔濾膜,作為枸杞的類胡蘿蔔素提取液供試品。
1. 3 分析方法
1. 3. 1 甜菜鹼提取液的分析
色譜柱為Agilent Zorbax NH2 相柱(其高×直徑為250mm×4.6mm ,填料粒徑為5μm);流動相為水-乙腈溶液(體積比為15∶85),流速為1.0mL/min ,等梯度洗脫,溫度為20℃,紫外檢測波長為190～380nm ,進樣量為10μL。
1. 3. 2 類胡蘿蔔素提取液的分析
色譜柱為Hyper sil ODS C18 柱(其高×直徑為250mm×4.0mm,填料粒徑為5μm),流動相為乙腈-二氯甲烷溶液(體積比為60∶40) ,流速為1.0mL/min ,等梯度洗脫,溫度為20℃,紫外可見檢測波長為360～780nm,進樣量為10μL 。
2 實驗結果
2. 1 甜菜鹼提取液的指紋圖譜分析
檢測波長為195nm 時,3個樣本的甜菜鹼提取液的色譜圖可見,樣本1與樣本2和樣本3的色譜峰差異較大,而樣本2 和樣本3的峰基本一致,即指紋圖譜的特徵性一致,因此,可定性地認為樣本2和樣本3同屬一個品種。
相對單儀器的色譜分離來說,高效液相色譜-二極體陣列檢測器聯用儀( HPLC-DAD)所得數據為三維數據,即數據同時包含了光譜與色譜信息。光譜能提供化學物質的大量定性信息,而色譜曲線能提供定量信息。當然,如果條件控制得好,化學物質的保留時間對化學物質的定性也是很有幫助的,但是,在指紋圖譜研究中,由於樣本量大,很難實現樣本之間的完全無漂移或其他問題,而聯用儀產生的三維數據中的光譜信息則為指紋圖譜研究提供了新的信息。
樣本2的色譜流出曲線,其中包含17個峰,甜菜鹼提取物色譜峰中12 個峰的紫外光譜,這為甜菜鹼的定性工作提供了有利的依據。
2. 2 類胡蘿蔔素提取液的指紋圖譜分析
檢測波長為456nm 時,3個枸杞樣本的類胡蘿蔔素提取液的色譜圖可見,3個樣本的類胡蘿蔔素提取液的色譜圖很相似,根據本實驗室的中藥指紋圖譜相似性軟體計算,其相似性大於90%。可以認為這7個峰是枸杞的共有峰和特徵峰,因此,可將枸杞類胡蘿蔔素提取物的HPLC 圖作為指紋圖譜進行藥材真偽的鑑定。
以樣本1為例,類胡蘿蔔素提取液的色譜;分離後的類胡蘿蔔素提取液的每個峰的紫外光譜。
3 討 論
從枸杞2種提取方法所得的色譜指紋圖譜來看,枸杞類胡蘿蔔素提取液分析所得的指紋圖譜之間差異很小,說明採用這種提取方法能找出枸杞的特徵性峰,為有效鑑別樣品的真偽提供了一定的依據;另外,在指紋圖譜研究的初級階段,需建立藥材的不同種屬間藥材指紋圖譜共有模式。可以看出,枸杞的共有峰很明顯,因此,採用這種方法建立共有模式較容易。而枸杞甜菜提取液各樣品的指紋圖譜差異很大,它正好反映出枸杞各種屬之間的差異。因此,用甜菜鹼提取液對枸杞進行種屬的鑑定比用類胡蘿蔔素提取液對枸杞進行種屬鑑定更合適。由圖可看出,用甜菜鹼提取液指紋圖譜要建立一個枸杞指紋圖譜的共有模式是非常困難的。尤其在相對樣本數不多或缺乏必要的數據積累的情況下,通過建立共有模式,制定合理的相似性標準,對甜菜鹼提取液進行分析,會引起相
當大的誤差,而採用類胡蘿蔔素提取液的指紋圖譜相對合理。
從枸杞指紋圖譜的研究來看,採用一種固定的提取方法和分析方法進行指紋圖譜的研究存在一定的缺陷。因為採用不同提取方法所得到的指紋圖譜可能從不同側面反映該藥材的特徵,從而構成其全貌,且其中每一張指紋圖譜都有其相應的特徵。而1張指紋圖譜一般很難反映一個藥材的整體特徵,不能解決研究中碰到的一系列問題。
4 結 論
a. 中藥枸杞的液相色譜指紋圖譜對提取方法具有很強的依賴性,用枸杞甜菜鹼提取液的液相色譜指紋圖譜進行品種的識別效果較好,而採用類胡蘿蔔素提取液的液相色譜指紋圖譜有利於枸杞真偽的識別和共有模式的建立。
b. 高效液相色譜雖是一種重要的中藥指紋圖譜研究方法,但是在實際應用中,採用一種固定的提取和分析方法進行指紋圖譜的研究,缺乏科學性。因此,在進行中藥指紋圖譜研究時,如何根據具體問題選擇不同方法建立指紋圖譜,是指紋圖譜研究中必須解決的問題。
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