來源：www.bioon.com 2006-12-17 01:39
摘要:用高效液相色譜法建立了知母藥材的指紋圖譜分析方法。採用Zorbax Eclipse XDB2C18色譜柱(5μm ,4.6 ×250mm,Agilent),流動相為乙腈和25mmol/L KH2PO4緩衝液,梯度洗脫;流速:1.0mL/min ;柱溫為25℃;檢測波長257nm。確定了8批不同產地知母藥材甲醇提取部分6個共有峰,各產地藥材指紋圖譜與對照指紋圖譜相似度良好(> 0.9) ,可以用來作定性研究。方法準確可靠,為提高知母藥材質量控制標準提供參考。
關鍵詞:知母;指紋圖譜;高效液相色譜法
中藥知母(Rhizoma anemarrhenae) 為百合科植物知母(Anemarrhena asphadeloides Bge) 的乾燥根莖,為常用中藥,具有滋陰降火、潤燥滑腸之功效,其主要成分有皂苷類,黃酮類,木脂素等。研究表明芒果苷是其清熱作用的有效成分,此外還具有祛痰鎮咳、強心、利尿、抗憂鬱、消炎抗病毒以及免疫抑制作用。知母的植物資源分布很廣,不同產地知母中芒果苷和新芒果苷含量差異較大,造成了藥材質量的不規範,品質各異。為了避免知母藥材質量差異影響到其進一步的開發利用,需要建立起一套能嚴格控制藥材內在質量的技術手段。
中藥指紋圖譜是近些年迅速發展起來的中藥質量控制模式,相對於以前用單個或少數主要成分作為指標來控制中藥材質量的方法,中藥指紋圖譜能較為全面的反映藥材的內在質量,具有系統性、整體性和穩定性等特點。關於知母藥材指紋圖譜的研究尚未見報導,本實驗選用知母藥材甲醇提取部分作為考察對象,建立知母藥材HPLC指紋圖譜,並且應用本實驗室開發的中藥色譜指紋譜相似度計算軟體進行化處理,結果證明,分析結果能夠反映各產地知母藥材的內在質量差異。
1 實驗部分
1. 1 儀器與試藥
Agilent 1100 高效液相色譜儀(包括:四元泵,脫氣機,自動進樣器,柱溫箱,二極體陣列紫外檢測器);中藥指紋譜相似度計算軟體(本教研室開發編制) 。
知母生藥來源見表,由第二軍醫大學藥學院生藥教研室陳萬生副教授採集鑑定,並按照《中國藥典》2000 版(一部) 規定進行乾燥,切片,粉碎,過40目篩等預處理。芒果苷、新芒果苷對照品也均由生藥教研室製備,經面積歸一化法檢查,純度均在98%以上;甲醇、乙腈購自Fisher 公司,色譜純;水為純淨水。
1. 2 實驗方法
1. 2. 1 色譜條件 色譜柱:Zorbax Eclipse XDB2C18柱(5μm ,4.6×250 mm,Agilent) ;流動相:採用梯度洗脫,A相為乙腈,B 相為25mmol/ L KH2PO4 緩衝液(pH 3.0) ;流速:1.0mL/min ,運行時間60min,DAD檢測,柱溫為25℃。兩次進樣之間用流動相初始梯度條件平衡15min。進樣量20μL 。
1. 2. 2 供試品溶液的製備 取知母藥材粉末約0.2g ,精確稱取,置25mL容量瓶中,加入25mL的體積分數80%甲醇溶液,超聲處理20min ,過濾,殘渣再用25mL的80%甲醇溶液超聲處理20min ,過濾,合併濾液,用少量甲醇溶液洗滌容器及殘渣,濾過,併入濾液,揮幹甲醇溶液,用甲醇溶解,置25mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,即得。
1. 2. 3 參照物溶液的配製 取蘆丁對照品適量,加甲醇溶解並稀釋成1.944mg/mL的溶液,搖勻,作為內標溶液。
2 結果與討論
2. 1 方法學考察
2. 1. 1 運行時間 依據《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行)》,考察了運行時間為120min的HPLC圖譜,確定60min之後再無峰出現,因此確定每次運行時間為60min。
2. 1. 2 穩定性 取同一份供試品溶液,按上述色譜條件,分別在0 ,2 ,4 ,8 ,16 ,24 ,36 ,48h 檢測。結果表明,各共有峰的保留時間和峰面積沒有明顯變化(RSD 均在3 %以內) ,樣品HPLC 指紋圖譜基本穩定。
對上述放置不同時間檢測的同一份供試品溶液的指紋圖譜進行相似度計算。相似度計算結果表明,各時間點測得樣品HPLC指紋圖譜相似性很好,表明樣品HPLC指紋圖譜穩定性良好。
2. 1. 3 精密度 取同一份供試品溶液,連續進樣5次,考察色譜峰的相對保留時間、相對峰面積的一致性。結果表明,各共有峰的相對保留時間和峰面積的比值基本沒有明顯變化(RSD均在3%以內)。
2. 1. 4 重複性 取同批次藥材粉末5份,依法測定,考察色譜峰的相對保留時間、相對峰面積的一致性。結果表明,各共有峰的相對保留時間和峰面積的比值基本沒有明顯變化(RSD均在5%以內) 。
2. 2 指紋圖譜分析
2. 2. 1 共有峰 取各產地藥材供試液,依次進樣,重複操作3次,記錄色譜圖。考察8批知母藥材樣品的色譜圖,提取藥材的共有模式作為對照指紋圖譜,60min內有6個色譜峰是8批知母共有的,因此,確定它們為共有指紋峰。其中,2號峰為新芒果苷,3號峰為芒果苷,S為參照物蘆丁對照品。
2. 2. 2 指紋圖譜相似度計算 以8批不同產地的知母藥材HPLC圖譜建立其共有模式指紋圖譜,對8批樣品的HPLC圖譜進行相似度計算。
2. 3 討論
2. 3. 1 藥材前處理條件 文獻報導中,製備知母提取物多採用甲醇溶劑索氏提取法,試驗中以新芒果苷和芒果苷的含量為指標,選擇考察了索氏提取和超聲波提取兩種方法的提取效率。採用正交設計法對超聲波提取方法的提取溶劑比例、提取時間和提取次數進行了考察,並與不同回流時間的索氏提取結果比較。試驗結果表明,採用「1. 2. 2」項下方法,芒果苷和新芒果苷的提取效率最高,確定為最佳條件。
2. 3. 2 檢測波長 從新芒果苷對照品溶液和芒果苷對照品溶液的紫外吸收光譜圖可以看出,二者在波長為257nm 處均有最高吸收峰,故選取257nm作為檢測波長。
2. 3. 3 梯度洗脫程序 中藥材的成分複雜,選擇單一流動相一般無法使各成分很好的分離,而採用梯度洗脫通過調節控制洗脫程序可以使樣品各成分在整個分析時間段(60min) 內充分分離。在中藥色譜指紋圖譜中,在首先保證指標成分完全分離的前提下,應儘可能的使所有色譜峰都能分離,以便準確的反映各色譜峰對應的成分的含量信息。同時,為了保證方法的穩定和重現,分離度應稍大,各色譜峰間距應比較均勻一致。試驗中先後考察了不同組成、不同比例流動相以及不同洗脫坡度的分離效果,獲得了分離效果較好的梯度洗脫程序。
2. 3. 4 共有峰的確定 對於共有峰的確定,目前在研究中還很不統一,有文獻報導採用八強峰的方法。然而在中藥材中,活性成分有時並不是含量較高的組分,而可能是一些含量很低的組分,因此,用八強峰作為評價指標並不能適用所有情況。本實驗依據國家頒布的《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行) 》,通過採用不同產地知母藥材樣品,建立其共有模式作為對照指紋圖譜,根據對照指紋圖譜的特徵以及已知的活性成分(如芒果苷) ,確定共有峰,並以已知的活性成分作為指標性成分評價其質量優劣。
2. 3. 5 指紋圖譜相似度評價 相似度表示的是樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜間的相似程度,綜合了樣品的定性信息和定量數據。由表相似度計算結果可見,各產地知母藥材指紋圖譜與對照指紋圖譜間相似性良好,反映了藥材的同源性,可以用來作定性研究。各產地樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度高低順序為安徽亳州(0. 996)>江蘇南京(0.9758)> 山西太原(0.968)>山東煙臺(0.958)>湖南邵陽(0.947)> 湖南長沙(0.934)>山東濟南(0.934) ,與其活性成分含量的高低具有相關性,能夠反映各產地知母藥材的內在質量差異。
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