來源：www.bioon.com 2006-12-17 01:46
摘要:目的:建立知母藥材的HPLC指紋圖譜並對圖譜進行評價。方法:採用HPLC法對知母水提液正丁醇萃取物作指紋圖譜,用相似度軟體評價其相似性。結果:經相似度軟體評價,同一產地知母藥材的指紋圖譜有較好的相似性,不同產地之間有一定差異。結論:本研究能對知母藥材更科學有效地控制其質量。
主題詞:知母/分析;色譜法;高壓液相
《中國藥典》(2000年版171頁)記載的知母為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge. 的乾燥根莖,春秋兩季採挖,除去鬚根及泥沙,曬乾,習稱「毛知母」;除去外皮,曬乾,習稱「知母肉」。文獻研究表明,知母主產於河北省,主要含知母甙約6%,從中檢出6種皂甙。另外知母根莖中還含有芒果甙、菝葜皂甙元等多種皂甙元、知母多糖以及多種金屬元素。知母皂甙的提取工藝多採用經典的醇提、脫脂、正丁醇萃取、丙酮重結晶方法。藥理研究表明,知母總皂甙能抑制Na+ - k+ - ATP酶活性,知母多糖有降血糖的作用,具有清熱瀉火、生津潤燥之功效。知母研究通常採用薄層掃描法或高效液相色譜法測定菝葜皂甙元、薩爾薩皂甙元的含量。然而,單一的某一成分含量測定不能完全反映中藥的藥效作用。指紋圖譜技術是反映中藥作用機理的最有效途徑,也是中藥現代化的關鍵技術之一,指紋圖譜質量控制技術是中藥質量控制最先進的技術。本文按現行大多數中成藥最常用的水提方法,提取中藥材知母的水溶成分經正丁醇萃取後做指紋圖譜。實驗證明樣做出的指紋圖譜不僅能反應中藥材知母的大多數有效成分,而且能從圖譜中的信息有效地控制中藥材知母的質量。並成功運用指紋圖譜(國家藥典委員會推薦試用中藥指紋圖譜相似度計算軟體之一)計算出各自的相似
度,說明其專屬性和可行性。
1 實驗材料
1. 1 樣品 本研究共收集河北、河南、湖南和安徽產知母藥材樣品14個。1號樣品產自河南嵩縣,2號樣品產自湖南岳陽,3號樣品產自河北安國, 4號樣品產自河北安國,5號樣品產自河北安國, 6號樣品產自河北安國, 7號樣品產自河北安國, 8號樣品產自河北博野, 9號樣品產自河北安國, 10號樣品產自河北博野, 11號樣品產自河北安國, 12號樣品產自河北安國, 13號樣品產自安徽, 14號樣品產自安徽。
1. 2 儀器 Agilent 1100 Series系列高效液相色譜儀;分析軟體: HP色譜工作站軟體, HP三維光譜軟體,計算機輔助相似性評價系統(中南大學中藥現代化研究中心) ;色譜柱:Hydrosphere C18,S-5μm,12nm,250×4.6mm;流動相:乙腈-0.01%磷酸二元梯度洗脫; 流速1ml/min; 檢測波長236nm;柱溫:30℃。主要試劑:甲醇、乙腈、醋酸乙酯、二次蒸餾水、磷酸。其中乙腈為色譜純,甲醇為色譜純和分析純,其餘均為分析純。
1. 3 供試品的製備及測定法 稱取知母10g,加蒸餾水80ml回流提取2h,冷卻後濾紙過濾,濾液用50ml正丁醇萃取1次,正丁醇層蒸乾,殘渣用甲醇適量溶解,定容置10ml。精密吸取供試液10ul,收集60min的色譜圖。
2 指紋圖譜的建立
知母指紋圖譜特徵是在HPLC指紋圖譜上主要有5個特徵峰,為了便於分析,把整張圖譜分成I、II兩個區域。其中I區是特徵區,典型的特徵是3號峰為一特強峰, 1號、2號、3號峰依次增強。II區是指紋區, 4號指紋峰為一組較弱的吸收峰群, 5號指紋峰也由兩個弱吸收峰和一個較強吸收峰組成。
3 方法學考察
3. 1 穩定性試驗 精密吸取同一樣品溶液10μl,每隔1h進樣1次,連續7h,結果7h內指紋圖譜比較穩定,相似度係數RSD=1.21%。
3. 2 精密度試驗 精密吸取同一樣品溶液10μl,連續進樣6次,相似度係數RSD=1.05%。
3. 3 重現性試驗 取同一批號的知母5份供試品,按供試品測定法操作,測定指紋圖譜,結果表明,本方法重現性良好,指紋圖譜相似度係數RSD=1.81%。
4 結果與討論
4. 1 由於指紋圖譜分析帶有綜合、宏觀、模糊的非線性特性,更能適應中醫藥傳統理論的需要。雖然它不能代替含量測定,但指紋圖譜依靠圖譜本身提供的豐富信息卻能很好的鑑別其品種和來源,說明其道地性。從圖2中可以明顯看出安徽產知母指紋圖譜的特徵區內1號峰顯著降低, 3號峰完全缺失。
4. 2 本實驗通過對14批不同產地知母建立其共有模式並進行相似度計算,結果發現不同產地知母藥材有較高的相似度,但也存在有一定差異,如湖南、安徽產知母的相似度均在0.8612以下。
4. 3 對於成分複雜的中藥,指紋圖譜比測定任何單一成份所提供的信息均要豐富和有用得多,如果能結合藥效學和分子化學手段以及計算機輔助相似性評價系統,還可對指紋圖譜中與藥效有關的信息進行判別,這將使得中藥的質量與藥效真正吻合,也才有可能較好地解決如何體現中藥的整體性和複雜性的難題。
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