» 高效液相色譜-庫侖電極陣列法檢測山茱萸的指紋圖譜研究
來源：www.bioon.com 2006-12-17 01:33
摘 要:採用高效液相色譜-電化學(庫侖電極) 陣列檢測技術,以馬錢素、熊果酸以及齊墩果酸為分析對象,對不同產地山茱萸的指紋圖譜進行了初步研究. 結果表明,該方法的重現性良好,從不同產地山茱萸指紋圖譜比較得出結論,不但佛坪地區樣品之間的相似度良好,而且全國各地山茱萸產區的樣品也有較好的一致性. 該方法簡單、準確,可用於對山茱萸的質量控制.
關鍵詞:山茱萸; 高效液相色譜; 庫侖電極陣列檢測技術; 指紋圖譜
山茱萸( Macrocarpium of f icinale) 是山茱萸科(Cornaceae) 山茱萸屬( Macrocarpium) 植物的乾燥成熟果肉,主產於我國的陝西、浙江、河南等省,四川、安徽、山東、山西亦有栽培. 山茱萸果肉藥性微溫,味酸澀,歸肝,具有補益肝腎、澀精斂汗,固虛脫等功效,可用於治療眩暈耳鳴,腰膝酸痛、陽痿遺精、遺尿尿頻、虛汗、神經衰弱、內熱消渴、月經不調等病症. 雖然山茱萸在我國栽培歷史久遠,但長期以來一直採用種子繁殖,且由於環境條件的差異,種內變異較大,導致現有結果樹種良莠不齊,產量高低不一. 樣既不利於山茱萸的市場流通,也不利於山茱萸種質資源的保護和開發利用,而且成為限制其進一步走向國際市場的瓶頸.
通過建立中藥指紋圖譜可以全面反映中藥所含內在化學成分的種類和數量,進而反映中藥的質量,是中藥的新型的生產質量標準. 它可以確保藥品的一致性,療效的安全性及可靠性. 電化學( 庫侖電極) 陣列檢測器(elect rochemical detector) 是根據電化學原理和物質的電化學性質進行檢測的儀器,在液相色譜中,它可以檢測出所有電活性物質,因此,對那些沒有紫外吸收或不能發出螢光但具有電活性的物質,可採用電化學檢測法. 電化學陣列檢測器提供準確而精密的樣品特質分析,從中得到樣品的三維圖譜,即:時間、電勢和濃度. 對排列的多個電極按逐漸升高的方式施加不同的電勢,可更容易地檢測出具有不同氧化還原電勢的化合物,即使這些化合物的色譜性能相同,常規色譜法無法分開,也能檢測. 杜昱光等利用高效液相色譜2電化學(庫侖電極) 陣列檢測技術,考察了不同處理時間植物體內內源激素的變化情況及其他小分子物質的差異顯示,認為其具有很大的優勢. 我們採用高效液相色譜-電化學( 庫侖電極) 陣列檢測技術,對不同產地山茱萸的指紋圖譜進行了初步的研究,旨在為山茱萸藥材質量控制提供科學的依據,為山茱萸的GAP(Good Agriculture Practice) 建設標準的建立提供參考.
1 材料和方法
1. 1 材料
山茱萸科( Cornaceae ) 山茱萸屬( Macrocarpium ) 山茱萸( Macrocarpium of f icinale S ieb. et Zucc. ) . 收集的樣品見表1.
表1 山茱萸指紋圖譜樣品
Tab. 1 Samples of f ingerprints of Macroca rpium of f icinale
編號樣品編號樣品
1 陝西佛坪11 四川安縣
2 陝西佛坪12 陝西太白
3 陝西佛坪13 河南內鄉
4 陝西佛坪14 安徽亳州
5 陝西佛坪15 陝西周至
6 陝西佛坪16 貴 陽
7 陝西佛坪17 山西陽城
8 陝西佛坪18 浙江臨安
9 陝西佛坪19 陝西隴縣
10 陝西佛坪20 陝西丹鳳
實驗用甲醇、乙腈均為色譜純,購自美國Fishier試劑公司;標品熊果酸(Ursolic acid ,742 - 8701) 、齊墩果酸(Oleanolic acid ,0709 - 9803) 均購自中國藥品生物製品檢定所,馬錢素(Loganin ,2423980) 購自SIGMA 公司;實驗用水為高純水.
1. 2 儀器
高效液相色譜2電化學陣列檢測系統,包括582型泵、542 型自動進樣器、CoulArray 5600A 型電化學陣列檢測器及CoulArray for Windows 色譜工作站( ESA 公司,美國) .
1. 3 標準品溶液的配製
精密稱取齊墩果酸標準品3. 2 mg ,置10 mL 容量瓶中,用甲醇溶解並稀釋至刻度,搖勻,即得0. 32mg/ mL 齊墩果酸標準儲備液.
精密稱取馬錢素標準品4. 1 mg ,置10 mL 容量瓶中,用30 %甲醇溶解並稀釋至刻度,搖勻,即得0.41 mg/ mL 馬錢素標準儲備液.精密稱取熊果酸標準品5. 05 mg ,置5 mL 容量瓶中,用甲醇溶解並稀釋至刻度,搖勻,即得1. 01mg/ mL 熊果酸標準儲備液.
1. 4 樣品溶液的製備
精密稱取山茱萸粗粉(40 目) 1. 0 g ,置25 mL容量瓶中. 加25 mL 甲醇,稱重,超聲處理30 min ,取出,放置至室溫,稱重並補足損失甲醇量,過濾,並用10 mL 甲醇清洗濾紙,合併濾液,置蒸發皿濃縮.轉移至5 mL 容量瓶中定容,過0. 45μm 微孔濾膜後進樣.
1. 5 液相色譜及電化學陣列檢測器條件
Kromasil C18 色譜柱( 4. 6 mm ×250 mm ,5μm) 及其C18 保護柱;流動相A :30 mmol/ L 磷酸二氫鈉水溶液(pH 值為5) ,含5 %(體積分數) 乙腈. 流動相B :30 mmol/ L 磷酸二氫鈉水溶液(pH 值為5) ,含70 %(體積分數) 乙腈. 流速1. 0 mL/ min.線性梯度洗脫,洗脫程序為:100 % A(保持30 min)100 min-30 % A 0 min-0 % A (保持40 min) . 十六通道電化學陣列檢測器的檢測電勢為- 50～850mV ,以60 mV 遞增.
2 結果
2. 1 對照品的選擇
馬錢素為山茱萸中環烯醚萜甙類物質,電活性較強,為山茱萸中有效成分,故選為參照物之一. 熊果酸和齊墩果酸為山茱萸中主要有效成分,所以將熊果酸和齊墩果酸也選為參照物.
2. 2 圖譜測定時間的確定
取樣品溶液,注入高效液相色譜2電化學( 庫侖電極) 陣列檢測儀,記錄200 min 色譜圖,結果表明170 min 後無樣品峰出現,故確定圖譜記錄時間為170 min.
2. 3 穩定性及精密度試驗
取同一批山茱萸藥材,按1. 4 方法製備供試品溶液,分別在0 、4 、8 、12 、24 h 連續進樣5 次,記錄指紋圖譜,以齊墩果酸的保留時間與主通道和相鄰通道的峰面積比值兩個參數為參照,換算出各共有峰的相對保留時間和相對積分面積. 結果顯示,樣品溶液在24 h 內通過HPLC 分析結果穩定,共有峰的相對保留時間和相對積分面積相當一致,齊墩果酸的RSD 小於1. 5 % ,表明樣品溶液在24 h 內能夠保持較好的穩定性.
取同一批山茱萸藥材,按1. 4 方法製備供試樣品溶液,連續進樣5 次,記錄指紋圖譜,考察各共有峰相對保留時間及相對峰面積比值的一致性. 結果表明,供試樣品溶液中齊墩果酸相對保留時間及相對峰面積的RSD 均小於3 % ,表明儀器等整個檢測系統的精密度良好.
2. 4 重現性試驗
取同一批山茱萸藥材,按1. 4 方法製備供試液樣品5 份,分別記錄指紋圖譜. 結果表明,供試樣品溶液中齊墩果酸的相對峰面積及相對保留時間的RSD 小於3 % ,表明方法重現性良好.
2. 5 HPLC 指紋圖譜的相似度
分別記錄全國山茱萸產區的10 批樣品和陝西佛坪產區的10 批樣品的指紋圖譜,根據《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行)》,以參照物齊墩果酸峰的相對保留時間和相對峰面積為1 ,計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積. 根據20 批樣品的相對保留時間及指紋圖譜的整體譜峰特點對峰進行匹配,以相對峰面積的中值建立共有模式,以相關係數法進行樣品的相似度評價. 結果表明,佛坪樣品之間相似度良好;全國山茱萸產區的樣品也有較好的一致性. 以陝西佛坪山茱萸指紋圖譜共有模式與全國山茱萸指紋圖譜共有模式相比較,計算相似度,結果表明陝西山茱萸與全國樣品比較相似度較好.
3 討論
採用電化學陣列檢測器檢測化合物時,會在連續的通道上出現檢測信號,信號最強的通道為主通道,其前一通道及後一通道的信號強度與該通道信號強度的比值即為「峰面積比值」. 在一定的電勢條件下,每種化合物的「峰面積比值」是一定的,因此樣品中各物質的定性採用保留時間和「峰面積比值」兩個參數與標準品比較來確定. 其優勢體現在以下兩個方面: (1) 更高的檢測靈敏度; (2) 較好的檢測選擇性. 單通道檢測器需要大量的工作去選擇色譜柱和流動相,以使樣品中的所有化合物最大可能地分離開,但有時仍有共洗脫峰存在. 而庫侖陣列檢測器則可調節電極的電勢,使共洗脫峰在不同的電極電勢條件下檢測. 高效液相色譜-電化學( 庫侖電極) 陣列檢測技術有望在中藥指紋圖譜的研究中發揮更大的作用.對不同產地的20 批樣品分析結果表明,全國各地山茱萸產區的樣品也有較好的一致性,佛坪地區樣品的相似度高於不同地區的樣品,說明如果要保證藥材質量的穩定可控,固定產地具有重要的意義.
本網站所有註明「來源：生物谷」或「來源：bioon」的文字、圖片和音視頻資料，版權均屬於生物谷網站所有。非經授權，任何媒體、網站或個人不得轉載，否則將追究法律責任。取得書面授權轉載時，須註明「來源：生物谷」。其它來源的文章系轉載文章，本網所有轉載文章系出於傳遞更多信息之目的，轉載內容不代表本站立場。不希望被轉載的媒體或個人可與
我們聯繫，我們將立即進行刪除處理。
溫馨提示：87%用戶都在
生物谷APP上閱讀，掃描立刻下載! 天天精彩！