來源：www.bioon.com 2006-12-17 01:46
摘要:目的建立吳茱萸水溶性成分的HPL(:指紋圖譜，為鑑定吳茱莢藥材提供依據。方法色諳柱:Y WG-C18(250mm×4 .6mm,10um)，流動相:乙睛-0.4%磷酸梯度洗脫，流速:0一8m in為1.0mL/min,8一20min為0.5ml/min,20一35min為1.0mL/min，檢測波長327nm，柱溫30℃，進樣量20ul。結果測定的10批吳茱芡樣品有巧個共有峰，共有峰相對保留時間的RSD為0.24%一1.3%，相對峰面積的RSl)為11.8% -59.3%. 10批樣品之間的重疊率均在0.80以上，共有峰佔總峰面積均約在90%。結論本實驗首次建立了中藥吳茱芙中水溶性成分的HPLC指紋圖譜，為吳茱芡藥材的真偽鑑別提供了科學依據。
關鍵詞:吳茱萸;水溶性成分;指紋圖譜;綠原酸
由於受產地、氣候和生態環境等的影響，中藥材中主要成分差異較大，僅針對其中某一個成分進行定性定量分析，並不能有效地控制中藥材或中成藥的質量。，指紋圖譜已成為國際公認的控制中成藥和天然藥物質量的有效手段。指紋圖譜是指某種(或某產地)中藥材或中成藥中所共有的、具有特異性的某類或數類成分的色譜或光譜的圖譜。其特點在於:①通過指紋圖譜的特異性，能有效鑑別樣品的真偽或產地;②通過指紋圖譜主要特徵峰的含量或比例的制定，能有效控制樣品的質量，確保樣品質量的穩定性。吳茱萸[Evodiar utaecarpa(Juss.)Benth]是芸香科植物吳茱萸的乾燥成熟果實，具有溫胃止吐、溫脾止瀉、鎮痛、升高體溫等作用。本實驗利用HPLC研究了吳茱萸中水溶性成分，制定了吳茱萸水溶性成分的HPLC指紋圖譜，為吳茱萸真偽鑑別和質量監控提供依據。
1 儀器與試劑
HP 1100 高效液相色譜系列，HP1100化學工作站，YWG一C18(250mm×4 .6mm,10um)色譜柱，紫外檢測器。
乙睛 (色譜純)，乙醇、磷酸(分析純)，水為二次蒸餾水。綠原酸對照品(中國藥品生物製品檢定所)。吳茱萸樣品經張家口醫藥公司藥品質檢員唐風陽、我院中醫系教授韓貴清鑑定為Evodia nttaeca-rpa (fuss.)Benth。
2 實驗方法與結果
2.1 色譜條件
流動相和流速見表2(略)，檢測波長327nm，柱溫30℃。
2.2 溶液製備
2.2.1供試品溶液製備吳茱萸藥材幹燥、粉碎，準確稱量約2.0 g，用二次蒸餾水浸泡0.5 h，沸水浴提取1.5 h，冷卻後加乙醇至含醇量50%，靜置，過濾，濾液定容至50 mL。進樣前用0.45 fm水膜過濾。
2.2.2 對照品溶液製備精密稱取綠原酸對照品1.2mg，用水溶解並定容為10m L。進樣前用0.45um水膜過濾。
2.3 重複性、精密度與穩定性實驗
2.3.1 重複性實驗取7號樣品5份，按，」2.2.1」項下方法製備供試品溶液，進樣分析，進樣量20uL，分別記錄各色譜圖中峰面積佔總峰面積大於等於5%的峰(共有5個峰，相對保留時間分別為0.68,0.73,0.92,1.00,1. 17)的相對保留時間和相對峰面積。相對保留時間的RSD分別為0.32%, 0.27%,0.37%,0.48%和0.71%，相對峰面積的RSD分別為1.02%,1.25%,1.53%,1.39%和1.22%。說明本實驗方法具有較好的重複性。
2.3.2 精密度實驗利用「2.3.1」項下一份吳茱萸供試品溶液，連續6次進樣，進樣量20 tiL，考察各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果表明，各共有峰的相對保留時間基本一致，相對峰面積亦變化不大。單峰面積佔總峰面積大於等於5%的共有指紋峰，其相對保留時間的RSD為0.28%0.75%，相對峰面積的RSD分別為1.12%一2.38%.
2.3.3 穩定性實驗利用「2.3.1」項下一份吳茱萸供試品溶液，分別在1,2,4,8,24,48 h進樣，進樣量20uL，單峰面積佔總峰面積大於等於5%的共有指紋峰，其相對保留時間的RSD為0.27%一0.79%,相對峰面積的RSD為2.52%一3.66%。說明供試品溶液在48 h內穩定。
2.4 吳茱萸藥材HPLC指紋圖譜的建立取不 同 產 地的吳茱萸藥材，按「2.2.1」方法製備供試品溶液，進樣並記錄色譜圖。實驗中記錄了2h的色譜圖，發現40 min後不再有色譜峰出現。各樣品都有約30個峰，按峰高取前20個較強峰進行統計處理，10批樣品有15個共有峰。色譜圖顯示，某些成分的峰高變化較大，提示產地不同，一些成分的含量變化較大。實驗中發現，吳茱萸中含有綠原酸，保留時間為14.3一14.4 min，各共有峰保留時間與該峰保留時間之比得出相對保留時間，見表3。各共有峰面積與該峰面積之比得出相對峰面積，見表40
2.5 重疊率的計算
重疊率是從質的角度定性地說明樣品之間的相關性，重疊率利用下式計算重疊率=兩樣品共有峰的2倍/兩樣品的峰數之和×100%,10 批樣品之間的重疊率見表5.10批樣品間的重疊率都在0.80以L，說明不同產地吳茱萸之間的相關性較高。
2.6 相似度的計算
相似度是從量化的角度討論樣品之間的相關。相似度常以夾角餘弦、相關係數和歐氏距離來表示。有關運算公式見文獻[7]。本實驗以10批樣品相對峰面積的平均值為對照樣品，各樣品與其比較，利用計算機Excel軟體輔助計算，得出各樣品的相似度。見表6。由於無法得到10批樣品的平均色譜圖，選擇了相似度最高的即第10批樣品的色譜圖作為吳茱萸的指紋圖譜，見圖2.由表 6 可 知，10批樣品中第7批的夾角餘弦(0.969 1)和相關係數(0.937 3)最小，歐氏距離(0.4903)最大，亦即該批樣品的質量較次。如果設置夾角餘弦為0.96，相關係數為0.93，歐氏距離為0.5，則本實驗10批樣品都合格。根據本實驗分析結果，建議實際應用中設置夾角餘弦大於0.96，相關係數大於0.93，歐氏距離小於0.5為合格藥品。
2.7 共有峰的面積佔總峰面積的百分比
共有 峰 的面積佔總峰面積的百分比分別為92.15%，93.15%，90.33%， 88.89%，93.63%，92.88%,93.51%,90.80%,89.04%,92.11%。非共有峰的面積佔總峰面積的百分比除第4批以外均小於10%，基本符合指紋圖譜的要求。
3 討論
3.1 用吳茱萸水提液製作指紋圖譜，樣品預處理簡單，色譜系統穩定，出峰多，給出的信息充分，色譜峰之間的分離度較好，且基線平穩，可作為鑑定吳茱萸真偽和指導用藥的依據。
3.2 實驗中發現吳茱萸中含有綠原酸，含量約為1%(另文報導)。在本實驗條件下，綠原酸的保留時間為14.4 min，且該峰穩定，峰形對稱，響應值較高，出峰在色譜圖的中間位置，因此將它作為自身內標，得到指紋圖譜的相對保留時間和相對峰面積。
3.3 分析結果顯示，不同產地吳茱萸共有峰相對保留時間的RSD在0.24%一1.3%，重現性較高;共有峰相對峰面積的RSD為11.8%一59.3%，重現性較低。因此，用相對保留時間作為指紋圖譜，可信度較高。
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