來源：www.bioon.com 2006-12-17 01:33
摘要目的:建立川芎藥材的高效液相指紋圖譜,以控制其質量。方法:色譜柱為Zorbax SB - C18 ,柱溫為25 ℃,流速為1.0ml /min ,檢測波長為323nm ,以甲醇和0.1 %冰醋酸水溶液進行梯度洗脫,考察不同提取方式對川芎藥材指紋圖譜的影響;進行等度洗脫,考察川芎藥材在不同波長下的指紋圖譜。結果:採用超聲提取法進行梯度洗脫效果較好。結論:本方法可用於建立川芎藥材的指紋圖譜,且簡便、可靠、重現性好。
關鍵詞：川芎;高效液相色譜法;指紋圖譜;質量控制
中藥川芎為傘形科植物川芎(Ligusticum chuanxiong Hort1) 的乾燥根莖,味辛、微苦,性溫,具有活血祛淤、行氣開鬱、祛風止痛之功效。臨床上主要用於治療心血管、婦科等疾病。為控制川芎藥材的質量, 筆者按照國家藥典委員會關於《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行) 的通知》要求, 並參考相關文獻, 採用高效液相色譜法對川芎藥材進行了指紋圖譜研究。
1 儀器與試藥
1.1 儀器：1100 高效液相色譜系統,包括四元泵、光電二極體陣列檢測器(DAD) 、G137PA 自動脫氣機、標準自動進樣器、色譜工作站(美國Agilen 公司) ; 5200H 型超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司) 。
1.2 試藥：阿魏酸對照品(中國藥品生物製品檢定所, 批號: 0790 -200312) ; 川芎藥材(產於四川灌縣, 購於湖北省中藥材有限公司, 並經武漢大學藥學院張洪教授鑑定, 符合《中國藥典》2000年版要求) ; 甲醇為色譜純, 水為重蒸餾水, 冰醋酸及其餘試劑均為分析純。
2 方法與結果
2.1 供試品溶液的製備
2.1.1 超聲提取法: 準確稱取川芎藥材粉末2.0g , 置於具塞錐形瓶中, 加95 % (V/ V) 乙醇50ml , 放置過夜, 超聲提取20min , 過濾, 揮幹溶劑後加20ml 水溶解, 再分別以20 、20 、10ml 乙酸乙酯萃取3 次, 合併萃取液, 揮幹, 殘渣加甲醇溶解並定容至10ml 容量瓶中,經0145μm 微孔濾膜過濾,即得。
2.1.2 甲醇回流提取法: 取川芎藥材粉碎, 過60 目篩。再準確稱取川芎藥材粉末210g , 置於圓底燒瓶中, 加甲醇30ml , 並於70 ℃水浴中加熱回流提取, 沸騰後保持1h 再停止加熱。過濾至蒸發皿中,殘渣按同法再反覆提取1 次,過濾,合併2 次濾液,濾液濃縮後以甲醇定容至10ml 容量瓶中,經0.45μm 微孔濾膜過濾,即得。
2.2 對照品溶液的製備
準確稱取乾燥至恆重的阿魏酸對照品適量, 加甲醇配製成0.2g/ L 的對照品溶液,色譜詳見圖1 。
2.3 色譜條件及分析方法
2.3.1 梯度洗脫: 色譜柱為Zorbax SB - C18 (250mm ×4.6mm , 5μm) , 流動相為甲醇和1 %冰醋酸水溶液進行梯度洗脫(其中, 甲醇與1 %冰醋酸水溶液體積比於0min～40min 時從10 ∶90 變化至35 ∶65 , 40min～60min 時從35 ∶65 變化至70 ∶30 , 60min～80min 時從70 ∶30 變化至100 ∶0) , 柱溫為25 ℃,流速為110ml / min ,檢測波長為323nm ,理論塔板數以阿魏酸計不低於5 000 ,進樣量為10μl 。其中, 2 種提取方式下川芎藥材的指紋圖譜詳見圖2 。
2.3.2 等度洗脫: 色譜柱為Zorbax SB - C18 (250mm ×4.6mm , 5μm) ,分別採用甲醇- 水(30 ∶70 ,水中含015 %冰醋酸) 、甲醇- 水(40 ∶60 ,水中含0.5 %冰醋酸) 、甲醇- 水(20 ∶80 , 水中含0.5 %冰醋酸) 、甲醇- 水(30 ∶70 , 水中含1 %冰醋酸) 、甲醇- 水(40 ∶60 ,水中含1 %冰醋酸) 、甲醇- 水(20 ∶80 ,水中含1 %冰醋酸) 、甲醇和1 %磷酸水溶液(40 ∶60) 、甲醇-0.5 %磷酸水溶液(40 ∶60) 、甲醇- 0.25 %磷酸水溶液(40 ∶60) 的流動相進行等度洗脫,並分別考察323 、280、340nm 波長處的指紋圖譜。結果,流動相為甲醇- 水溶液(30 ∶70 ,水中含0.5 %冰醋酸) 時的色譜較好。由圖3 可知,A 、B 、C 分別為於323、280 、340nm 波長處所測得的色譜圖。其中,A 中峰3 、5 分別為阿魏酸、川芎嗪,B 中7、9 分別為阿魏酸、川芎嗪,C 中峰3、5 分別為阿魏酸、川芎嗪。
2.4 同一產地川芎藥材指紋圖譜及各項技術參數
根據比較測得的同一產地(四川灌縣) 10 批藥材(批號依次記為A 、B 、C……) 的指紋圖譜,結果表明, 10 個峰是各批供試品所共有的, 且峰面積較為穩定, 故筆者確定其為主要共有峰。其中峰3 為阿魏酸的色譜峰,標為S(參照峰) ,相對保留時間、相對峰面積分別詳見表1 、表2 。
3 討論
筆者比較了川芎藥材超聲提取和甲醇回流提取2 種提取方式對川芎有效成分指紋圖譜的影響。由圖2 可知, 2 種提取方式的主要有效成分的特徵峰都為10 個, 主要特徵峰所代表的有效成分相同, 但圖2 (A) 比圖2 (B) 分離度高, 作為柱效評價的重要指標———塔板數也比圖2 (B) 高得多; 而且,在甲醇回流提取方式中, 甲醇有很大的毒性, 而超聲提取利用乙醇為提取溶劑,則無毒、簡便易行,因此超聲提取的方法非常可行。
由表1 可知, 色譜峰的相對保留時間匹配較好, 相對標準差均小於1 % , 符合規定; 由表2 可知, 相對峰面積的相對標準差均小於3 % ,說明指紋圖譜的重現性良好。圖3 中, A 、C 中特徵峰較少, 說明等度洗脫不能使極性不同的組分得到很好的分離, 並且分離度與梯度洗脫相比小得多、塔板數也低得多, B 中峰數雖較多, 但前20min 峰較集中,影響了分離度, 而且峰形較梯度洗脫的峰形差。是因為中藥成分複雜, 利用等度洗脫很難將極性不同的組分全部洗脫下來,有些組分會殘留在色譜柱內,對柱子不好,時間過長有可能會堵塞色譜柱。利用梯度洗脫則可以克服以上缺點, 因此在對中藥材進行分析時最好採用梯度洗脫方式。
由於中藥材成分複雜、不同批次的質量相差懸殊、缺乏有效的質量控制措施等原因, 致使長期以來規範中藥材市場秩序的舉措收效甚微。因此, 制訂新的中藥材質量控制方案勢在必行。中藥指紋圖譜是綜合的可量化的色譜鑑別手段, 藉以鑑別真偽,評價中藥材、半成品和成品質量均勻性和穩定性,能更有效地控制中藥材的內在質量, 提高中藥材的穩定性。筆者採用高效液相色譜法, 建立了川芎藥材的指紋圖譜分析方法,結果表明,本方法穩定、可靠、重現性好,可用於川芎藥材指紋圖譜的建立,並可為其質量的全面控制提供參考。
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