摘要: 目的: 建立葛根(野葛) 的高效液相色譜(HPLC) 指紋圖譜。方法: 用反相高效液相色譜(RP- HPLC)DAD 法測定葛根的指紋圖譜, 並作相似度比較分析。結果: 初步建立了葛根的指紋圖譜。結論: HPLC 指紋圖譜法重現性好, 可作為葛根的一項質控指標。
關鍵詞: 葛根; 指紋圖譜; 高效液相色譜法
葛根為常用中藥, 系豆科植物野葛P ueraia lobata (W illd. )O -hw i. 或甘葛藤P ueraria thom sonii Benth. 的乾燥根, 具有解肌退熱、生津、透疹、昇陽止瀉之功效, 臨床常用於外感發熱頭痛、項背強痛, 口渴, 消渴, 麻疹不透, 熱痢, 洩瀉, 以及高血壓頸項強痛等症狀[1 ]。現代研究表明[2 ] , 葛根主要含有葛根素、黃豆苷、黃豆苷元等有效成分, 具有調節心臟功能及代謝、擴張冠狀血管和腦血管、抗心腦缺血和心律失常、降血壓、降血糖和血脂等藥理作用。
據記載和調查, 除上述2 種外, 同屬一些其他植物的根在少數地區也作葛根入藥。據成分檢測, 其他種葛根素含量甚微或無, 不宜藥用。為了進一步探討葛根的鑑別特徵, 有助於規範用藥, 本文採用高效液相色譜法對葛根(野葛) 指紋圖譜的構建進行了初步研究, 以期為葛根的藥材鑑別、質量評價以及質控標準制定提供依據。
1 儀器與試藥
A gilent 1100 液相色譜儀(自動進樣器) ,DAD 檢測器。葛根素對照品為實驗室自製。重蒸去離子水(實驗室製備) ,甲醇(上海化學試劑有限公司, 分析純; Tedia 公司, 色譜純) , 乙醇(上海化學試劑有限公司, 分析純)。
葛根採自浙江杭州、浙江湖州、湖南、河南、廣東等地或市售品, 採購時間為2002211, 共10 份樣品, 經筆者鑑定均為豆科植物野葛P ueraria lobata (W illd. )O hw i. 的乾燥根。
2 方法與結果
2. 1 供試品的製備
精密稱取葛根藥材粗粉0. 1 g, 置錐形瓶中,精密加入30% 乙醇50m l, 稱定重量, 加熱回流30m in, 放冷, 再稱定重量, 用30% 乙醇補足減失的重量, 濾過, 取續濾液, 用微孔濾膜(孔徑為0. 45um) 濾過, 濾液作為供試品。
2. 2 參照物的製備
精密稱取葛根素對照品, 加甲醇製成每1 m l甲醇含葛根素0. 2 mg 的溶液, 作為參照物。
2. 3 色譜條件
色譜柱為A gilent ZORBAX 80A Extend- C18分析柱(250 mm ×4. 6 mm , 5um) ; 流動相為75% 水溶液與25% 甲醇洗脫; 流速1. 0 m l/m in; 柱溫25℃; 檢測波長250 nm; 參比波長360 nm; 分析時間30 m in; 供試品及參照物進樣量各20uL。
2. 4 方法學考察
2. 4. 1 穩定性實驗：取同一批次供試品(湖州樣品) , 分別在0, 2,4, 8, 16, 24, 36 h 測定指紋圖譜, 用「中藥指紋圖譜相似度計算軟體」計算, 結果相似度均大於0. 94, 表明供試品在測定的36 h 內保持穩定。
2. 4. 2 精密度實驗取：同一批次供試品(湖州樣品) , 連續進樣5次, 測定指紋圖譜, 考查進樣精密度, 用「中藥指紋圖譜相似度計算軟體」計算, 結果相似度均大於0. 97, 表明供試品進樣精密度良好。
2. 4. 3 重現性實驗：取湖州樣品, 按供試品製備方法分別製備5份供試品, 測定指紋圖譜, 用「中藥指紋圖譜相似度計算軟體」計算, 結果相似度均大於0. 93, 表明本法測定的重現性良好。
2. 5 指紋圖譜的建立：取供試品溶液適量, 注入液相色譜儀, 按選定的測定條件, 進行檢測。同一上述實驗條件下, 測定所有供試品HPLC 色譜圖。根據10 批次供試品測定結果所給出的峰數、峰值(積分值)和峰位(相對保留時間) 等相關參數, 進行分析、比較, 制定優化的指紋圖譜。圖1, 圖2。
2. 6 指紋圖譜分析與評價：葛根高效液相色譜可分離出約10 多個色譜峰, 經與參照物對照以及比較所有測定和記錄的色譜圖,選取其中6 個共有峰作為指紋圖譜的特徵峰。其保留時間(m in)、峰面積如下。
2. 6. 1 共有指紋峰標定：根據10 批次供試品測定結果, 標定共有指紋峰。葛根HPLC 指紋圖譜中, 共有指紋峰6 個。與葛根素參照物峰(3 號峰) 相比, 其它5 個共有指紋峰相對保留時間依次為:0. 270, 0. 555, 1. 144, 1. 360, 1. 637。
2. 6. 2 共有指紋峰面積比：除葛根素參照物峰以外, 2、4 號共有指紋峰面積(峰) 超過總峰面積的10% , 規定2 號峰相對峰面積比值為0. 176 0～ 0. 326 9, 規定4 號峰相對峰面積比值為0. 211 1～0. 392 0。
2. 6. 3 相似度評價：將測試數據導入中藥指紋圖譜相似度計算軟體, 經選峰, 設定匹配模板, 將譜峰自動匹配; 然後設定標準模板, 進行譜峰差異性評價和整體相似性評價。通過中藥指紋圖譜相似度計算軟體得出葛根HPLC 指紋譜共有模式; 與共有模式比較, 不同產地葛根的相似度: 浙江杭州0. 95, 浙江湖州0. 92, 湖南0. 89, 河南0. 85, 廣東0. 90, 亳州藥市0. 87, 南京藥店0. 86。
3 討論
3. 1 本實驗對供試品製備、色譜條件進行了優化選擇。通過對不同提取溶劑、提取方法進行實驗比較, 對所得指紋圖譜進行反覆考察, 並結合葛根主含成分的性質, 擬定上述供試品的製備方法。經實驗比較, 選擇75% 水溶液與25% 甲醇為流動相, 能較好地使樣品中各色譜峰分離且出峰最多; 分析時間30 m in, 樣品1. 5 h圖譜顯示, 30m in 後無特徵峰出現。採用二極體陣列檢測器對檢測波長進行考察, 記錄並比較不同波長的色譜圖, 結果在250 nm檢測波長下, 色譜圖中色譜峰較多, 信息豐富, 故確立250 nm 為檢驗波長。
3. 2 據記載和調查, 除《中國藥典》收載的2 個品種外, 同屬一些其他植物的根, 如食用葛P. ed u lis, 三裂葉葛藤P. p haseoloid es,山葛P. m ontana, 峨嵋葛P. om eiensis 等, 在少數地區也作葛根入藥, 由於些品種葛根素含量甚微或無, 可以推斷其指紋圖譜中葛根素這一主要共有特徵峰不明顯或無, 以資進行品種鑑別。本實驗僅對葛根(野葛)HPLC 指紋圖譜的構建進行了初步研究, 仍需收集不同品種、不同產地的大量樣品, 進行系統、規範化的深入研究。
參考文獻:
[ 1 ] 國家藥典委員會. 中國藥典, É 部[ S ]. 北京: 化學工業出版社,2000: 273-274.
[ 2 ] 肖培根. 新編中藥志, 第1 卷[M ]. 北京: 化學工業出版社, 2002:926-970.
作者:陳斌, 劉訓紅, 蔡寶昌
來源:時珍國醫國藥2005 年第16 卷第5 期