不同產地佛手指紋圖譜及模式識別研究

不同產地佛手指紋圖譜及模式識別研究

吳春蓉1,2,3,黎珊珊1,2,3,肖雪1,2＊＊,樸勝華1,2＊＊,郭姣1,2

摘要：目的：建立不同產地佛手指紋圖譜，利用模式識別方法比較不同產地佛手的差異。方法：本文採用高效液相色譜法對4個產地25批佛手建立高效液相指紋圖譜，利用相似度評價技術、聚類分析、主成分分析進行分析研究。結果：從已建立的佛手指紋圖譜中確定26個共有峰，指認出4個共有峰，利用聚類分析、主成分分析可區分佛手產地。結論：研究結果表明，不同地理位置佛手藥材相似度存在一定差異，地理位置相近的佛手藥材相似度較高。

佛手為芸香科植物佛手Citrus medicaL.var. Sarco-dactylis Swingle的乾燥果實，其味辛、苦、酸、溫，歸肝、脾、胃、肺經，具有疏肝理氣、和胃止痛、燥溼化痰的功效。目前研究表明佛手具有抗氧化、抗炎、抗菌、降脂，抗腫瘤等多種藥理作用，其作為原材料被廣泛用於藥品、保健品、食品。《中國藥典》採用顯微鑑別、薄層色譜及橙皮苷含量評價佛手質量，而佛手成分複雜，產地眾多，品質參差不齊，諸如以上方法無法全面表徵佛手質量。指紋圖譜在中藥質量評價中正在被廣泛應用，它可充分地反映中藥中各化學成分分布的整體狀況。聚類分析是一種無監督的多元統計方法，能夠依據各自特徵進行合理分類。主成分分析通過降維，可用較少的主成分來反映原始指標的主要信息。

目前指紋圖譜結合模式識別來反映中藥不同產地間差異及內在質量的方法已經被廣泛應用。林樂維等，張瑞芳等分別建立了廣佛手高效液相指紋圖譜，結果顯示廣東地區佛手差異性較小，除此之外，全國其他產區佛手綜合研究相對較少。本文首次採用高效液相（High performance liquid chromatog raphy，HPLC）指紋圖譜技術結合模式識別方法分析不同產地多批次佛手間的差異，為評價不同產地佛手質量及其應用提供依據。

1儀器與試藥

佛手藥材均為市售，經廣東藥科大學李鍾副教授鑑定為芸香科植物佛手Citrus medicaL. var. Sarcodactylis Swingle的乾燥果實。

2方法與結果

2.1供試品溶液製備

取本品適量，粉碎，過65目篩，取約2 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇20 mL，稱定重量，超聲提取2次，每次30 min，放冷，甲醇補足重量，將兩次提取液混合，濃縮至20 mL定容，用0.45μm微孔濾膜濾過備用。

2.2對照品溶液製備

精密稱取對照品適量，置20 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，分別製成每1 mL含橙皮苷532.0μg、橙皮素507.0μg、甲基橙皮苷508.5μg、新橙皮苷530.0μg的溶液，經0.45μm的微孔濾膜濾過，即得。

2.3色譜條件

色譜柱為Sharpsil-U C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相為甲醇（A）-0.2%乙酸水（B）（pH=3.30）；洗脫方法為（0-14 min：5%-27%B；14-19 min：27%-44%B；19-45 min：44%-80%B）；流速為1 mL·min-1；檢測波長為254 nm；柱溫30℃；進樣量20μL。

2.4方法學考察

2.4.1精密度考察

取樣品GD01按「2.1」項所述方法製備佛手供試品溶液，按「2.3」項下色譜條件進行檢測，連續進樣6針，記錄所得色譜圖。以峰24為參照峰計算相對保留時間和相對峰面積並計算相對標準偏差。結果顯示，色譜峰的相對保留時間RSD均小於1.0%，相對峰面積的RSD均小於5.0%，表明儀器的精密度良好。

2.4.2重複性考察

取樣品GD01，按「2.1」項下方法平行製備6份佛手供試品溶液，按「2.3」項下色譜條件進行檢測，各供試品溶液進樣分析，記錄所得色譜圖。結果顯示，色譜峰的相對保留時間RSD均小於1.0%，相對峰面積的RSD均小於5.0%，表明方法重複性良好。

2.4.3穩定性考察

取樣品GD01，按「2.1」項下方法製備1份佛手供試品溶液，按「2.3」項下色譜條件分別在、2、4、6、8、12、24 h進行測定，記錄色譜圖。結果顯示，色譜峰的相對保留時間RSD均小於1.0%，相對峰面積的RSD均小於5.0%，表明樣品24 h內穩定。

2.5指紋圖譜的建立及評價分析

2.5.1樣品及對照品測定

分別取「1.1」中收集的25批佛手藥材和4種對照品，按「2.1」項所述方法製備溶液，按「2.3」項色譜條件進樣測定，記錄HPLC圖譜，25批樣品色譜疊加圖如圖1。

2.5.2參照峰的確定

在各批次樣品圖譜24號色譜峰分離良好，峰面積較大且為所有樣品共有，確定甲基橙皮苷的色譜峰為參照峰。

2.5.3佛手藥材指紋圖譜共有峰的確定

採用國家藥典委員會「中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012年版）」對25批佛手藥材HPLC圖譜進行結果分析，確定26個共有峰，指認了其中4個色譜峰的歸屬：峰22為橙皮苷，峰23為新橙皮苷，峰24為甲基橙皮苷，峰26為橙皮素。

2.5.4相似度評價

將所得25批佛手HPLC圖譜的cdf格式導入「中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012年版）」，選定GD01作為參照峰，時間窗口設為0.1 min，以中位數法建立對照指紋圖譜，如圖2；25批樣品與對照圖譜之間的相似度結果如表2。結果表明，收集到的25批不同產地的佛手具有一定的差異，廣東佛手相似度在0.846-0.978之間；廣西相似度在0.861-0.970之間；四川佛手相似度範圍為0.811-0.926之間；浙江相似度0.739-0.857之間。

2.6模式識別分析

2.6.1聚類分析（The cluster analysis，CA）

對25批佛手進行聚類分析，獲得包括甲基橙皮苷（峰24）在內的26個共有色譜峰，將各個共有峰面積導入SIMCA-P+13.0（Demo）軟體。根據聚類分析結果（圖3），25批佛手樣品分為4類，其中SC02-S05及GD05聚為一類，ZJ01-ZJ03聚為一類，其餘GX、GD交叉分布聚為兩類。

2.6.2主成分分析（principal components analysis，PCA）

將25批佛手樣品所得峰面積導入SIMCA-P+13.0（Demo），採用PCA方法進行分析，25批樣品的得分圖見圖4。表明樣品間的聚類情況，25批樣品可分為4組，其中浙江與廣東、廣西、四川偏離較遠，四川與廣東、廣西有略微差異，廣西、廣東聚類程度較高，GD05和GD08為廣東產地的離群點，此結果與CA結果一致。

3討論

3.1樣品條件的選擇

本文對不同提取方法（超聲、回流）進行了比較，並對不同的提取溶劑（10%、20%、40%、60%、80%、100%甲醇及水）以及提取次數（1次、2次）進行了試驗篩選。結果顯示，以80%甲醇為提取溶劑，採用超聲提取2次，每次30 min時所得供試品溶液的色譜峰信息較為豐富，因此確定該條件為提取條件。

3.2色譜條件的優化

本文分別對甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%乙酸水、乙腈-0.2%乙酸水等多種流動相系統，採用DAD全波長掃描進行考察，最終採用甲醇- 0.2%乙酸水（pH3.30）溶液為流動相梯度洗脫。同時檢測波長為254 nm，柱溫30℃時各色譜峰分離效果最好。

3.3不同產地佛手對比

相似度評價表明同一產地佛手相似度較高，廣東、廣西相似度較為相近，四川佛手與兩廣佛手略有差異，浙江金佛手與兩廣、四川佛手均具有明顯差異，為了進一步說明不同產地佛手的聚類情況，在此基礎上採用CA、PCA方法對25批樣品進行分析，CA及PCA的結果與指紋圖譜的結果幾乎一致，表明不同區域的氣候條件、生態環境對其地域內所產的藥材質量有很大的影響。因此針對不同產地佛手之間的差異，對其應用應因地制宜。

通過HPLC指紋圖譜及模式識別對佛手的綜合評價，既說明不同產地佛手的整體特徵，反映其內在質量，又進一步結合模式識別方法分析不同產地佛手的聚類情況，使結果更科學、全面。對於不同產地佛手差異性成分，今後將做進一步的分析，期望能夠全面展示不同產地佛手之間的差異，為控制其內在質量提供依據。

文章來源：吳春蓉,黎珊珊,肖雪,樸勝華,郭姣.不同產地佛手指紋圖譜及模式識別研究[J].世界科學技術-中醫藥現代化,2017,19(05):820-824.版權歸原創作者所有。獵藥人轉載只為傳播中藥知識，不做商業用途，如不適合轉載，請後臺留言聯繫編輯，本平臺將予以刪除處理。感謝原作者的辛勞研究與付出。