» 山麥冬的HPLC/ESI-MS特徵指紋圖譜研究
來源：www.bioon.com 2006-12-17 01:46
摘要: 目的：研究山麥冬Liriope spicata 甲醇提取物中的物質組成情況,建立山麥冬HPLC/ESI-MS特徵指紋圖譜。方法：山麥冬用甲醇超聲提取, 提取液經C18SPE固相萃取柱除去多糖成分後,用高效液相色譜2電噴霧離子
阱質譜(HPLC/ESI-MS)分析提取物中的物質組成。結果：山麥冬甲醇提取物色譜圖中有17個共有峰的重現性與精密度的RSD<5%,建議以此為基礎製作山麥冬特徵指紋圖譜。結論：應用HPLC/ESI-MS技術建立的山麥冬指紋圖譜特徵性強、重現性較好,可用於山麥冬的品質評價與品種鑑別。
關鍵詞:湖北麥冬;高效液相色譜-電噴霧離子阱質譜;指紋圖譜
山麥冬為百合科植物湖北麥冬Liriope spica ta(Thunb.) Lou r. var. prolifera Y. T. Ma和短葶山麥冬L. m usca ri (Decne. ) Bailey 的乾燥塊根,主要成分有三萜皂苷、多糖及異黃酮等。由於受產地、氣候、生態環境以及採集時間等因素的影響,不同來源山麥冬藥材中所含主要成分差異較大。因此,僅針對其中某個有效成分進行定性或定量分析並不能有效控制藥材的質量。關於山麥冬、麥冬皂苷類成分提取、結構分析及定量測定研究已有許多文獻報導,但未見有關山麥冬皂苷類成分指紋圖譜研究的報導。高效液相色譜2質譜聯用技術集液相色譜分離能力強和質譜靈敏度高、定性能力強於一體,是用於中藥活性成分研究的最有效的分析手段之一[ 8 ]。筆者曾研究了麥冬皂苷提取物的電噴霧質譜特徵圖譜,本實驗應用高效液相色譜2電噴霧離子阱質譜(HPLC/ES I-MS)研究了山麥冬藥材甲醇提取物指紋圖譜,該指紋圖譜特徵性強、重現性良好,可用於山麥冬藥材的鑑別及質量評價。
1 儀器, 材料與試劑
美國Finnigan 公司LCQDUO 型液質聯用儀,包括ESI( 電噴霧電離)源,TSP4000泵及TSPA S3000自動進樣器,H ighchem 公司Mass Fron-tier 1.0質譜解析軟體。
1～10號藥材來源分別為: 1號對照藥材,中國藥品生物製品檢定所,批號11362200001;2號藥材2000年3月採於襄陽歐廟山麥冬藥材GAP種植基地;3～10號藥材於2001年11月採於襄陽歐廟,地點分別為歐廟張東一組、歐廟李堖村一組、歐廟張東三組、歐廟桃圓村一組、歐廟肖州村二組、歐廟肖州村四組、歐廟大洲村二組和歐廟李灣村二組。上述藥材經本院植物分類學王萬賢教授鑑定為湖北麥冬L. sp ica ta (Thunb. ) Lou r. var. p rolif era Y. T.M a。乙腈為色譜純, 其他試劑均為分析純。
2 方法與結果
2.1 測定條件: 色譜條件: AICHROM TM Reliz Sil C18 色譜柱(150mm×2.1mm,5μm) ,流動相10mmol/L乙酸銨-乙腈(60min 內乙腈體積分數變化為25% →60% ),體積流量0.2mL/min,進樣量15μL。質譜條件: 掃描範圍m /z 300～1200,離子源噴射電壓4.5kV ,毛細管電壓-45V ,毛細管溫度230℃, 鞘氣(N 2)流速50個單位,輔助氣(N2)流速10個單位,負離子檢測。
2.2 供試液的製備:精密稱取山麥冬對照藥材粉末0.3g於離心管中,超聲提取2次(每次15min),每次加甲醇溶液5mL,離心取上清液,合併兩次提取液並用甲醇定容至10mL。取甲醇提取液1mL稀釋至20mL 後,加壓通過已活化的C18 SPE固相萃取柱,先用10mL 水洗除去多糖等成分,後用甲醇1mL洗脫。收集甲醇洗脫液作為山麥冬對照藥材供試液。其他產地藥材同法製備。在計算各峰強度時,將各樣品中每個峰的峰面積除以對照藥材中相應峰的峰面積,得到的比值作為樣品中該峰的相對峰面積(Ar)。
2.3 供試液HPLC/ESI-MS 特徵圖譜: 分別取各山麥冬藥材供試液15μL 進樣分析,對照藥材和2號藥材的色譜圖。取對照品藥材供試液連續進樣5次,在峰強大於10%的色譜峰中,保留時間( tR ) 及A r的RSD均小於5% 的共有峰有17個。分析5份平行提取的山麥冬對照藥材供試液,上述17個共有峰的tR及Ar的RSD亦小於5%。取空白溶劑15μL ,在同樣條件下進樣分析,沒有發現上述17個共有峰。樣1 (對照藥材) 中17個共有峰的實驗數據見表。
3 討論
3.1 共有峰初步定性分析:根據山麥冬樣品的ESI-MS負離子全掃描質譜和源碰撞誘導解離( source co llision-induced dissociative, SCID ) 實驗,上述17個共有峰均為準分子離子峰[M-H]- 。進一步進行MS-MS 分析表明,除了m/z 655.9峰外。各子離子峰均是母離子峰失去糖基的碎片峰,故初步推斷上述共有成分為山麥冬皂苷成分。其中m/z 721.5、853.5、895.4 和1047.5與文獻報導的山麥冬皂苷成分的相對分子質量及質譜碎裂規律相同(分別為麥冬皂苷A、薯蕷皂苷元-1-O-β-吡喃夫糖-3-O-α-吡喃鼠李糖苷、25 (S )-魯斯可皂苷元-1-O -[α-吡喃鼠李糖基(1→2) [β-吡喃木糖基(1→3) ]-β-吡喃夫糖苷和薯蕷皂苷元-3-O-α-吡喃鼠李糖苷-(1→2) ]- α-L -吡喃鼠李糖苷-(1→3) -β-吡喃葡萄糖苷)。因此,可以選擇上述17個共有峰作為山麥冬HPLC/E S I-MS指紋圖譜的主要分析對象。
3.2 指紋圖譜的聚類分析:聚類分析法可通過數學的方法來替代人們主要靠經驗和專業知識來進行的傳統分類工作,將它用於中藥指紋圖譜分析,不僅可鑑別出藥材的真偽,而且可以對同品種不同產地的藥材進行品質評價。本實驗選擇多元統計分析中的聚類分析方法對各共有峰Ar實驗數據(相應的共有峰峰面積數據見表)進行分析, 採用Euclidean距離法計算樣品間的距離,用Ward方法進行系統聚類,結果見圖。聚類圖中縱坐標是樣品, 橫坐標表示樣品間的相似程度。以1號山麥冬對照藥材為標準,2～10號樣品與之比較進行品質評價,連接它們的縱向線越短,說明兩樣品間的差距越小。從該聚類圖中可以得到以下結論: 樣1為對照藥材,樣2與之距離最短,說明樣2 藥材與對照藥材最相似;樣4、8、10 可聚為一類,與對照藥材1的相似性較大;樣3、5、6、7、9可聚為一類,其藥材均採集於11月,說明採集時間相同的藥材具有一定程度的相似性。
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