蛋白質是生命功能的最終執行者，也是臨床診斷、疾病分型、藥物篩選等生物醫學相關領域重要、應用廣的檢測對象。免疫檢測一直以來在蛋白質檢測中佔據著主導地位。免疫檢測技術如ELISA，CLIA等的靈敏度一般只能達到pg/mL水平。然而，在疾病早期，精確檢測這些超低豐度蛋白又對預判疾病的發生與轉歸有著重大意義，伴隨著大健康產業和精準醫學的發展，傳統方法的技術瓶頸與巨大市場需求之間的矛盾日趨凸顯。本期推送主要介紹Digital ELISA的技術原理及產業化情況。
Digital PCR是目前絕對定量PCR的主要技術方式，通過對樣品的微滴化處理，使每個單元包含沒有、一個或者多個拷貝的目標分子，在每個反應單元中分別對目標分子進行PCR擴增，擴增結束後對各個反應單元的螢光信號進行統計學分析。由於不需要對其擴增曲線進行監控，不受擴增效率影響，擴增結束後通過直接計數或泊松分布公式來計算每個反應單元的平均濃度達到絕對定量的目的。
同樣的理念目前已用於開發其它數位化檢測技術，如Digital ELISA、Digital LAMP和Digital RPA。為了實現更低濃度蛋白質檢測，Quanterix採用類似於Digital PCR的方式開發了Digital ELISA。它們稱這個技術為Simoa（Single-molecule Array），Simoa技術靈敏度比ELISA高1000倍以上，它的出現將蛋白質檢測技術直接帶入到單分子、數位化檢測時代，成為fg級超低豐度蛋白質檢測領域的優勢技術。
什麼是Digital ELISA
Digital ELISA，也稱為Simoa技術，與傳統免疫試驗主要區別在於Simoa能夠在飛升大小的孔中捕獲單個分子，允許單個磁珠信號的數位化讀取。Simoa最早的報導源自於2010年naure biotechnology的報導。本質上SIMOA的設計理念和Digital PCR很像。
Simoa所採用的Digital ELISA基本原理和Digital PCR類似。為了檢測血液中的低豐度蛋白質，Simoa用特異性抗體修飾的微珠捕獲靶標生物標誌物，在生物標誌物濃度很少時，每個珠子能捕獲一個或零個靶蛋白質分子，通過免疫反應後形成免疫複合物，然後用能夠產生螢光產物的酶報告信號。通過把單個珠子限定在50 fL反應室中，使用螢光成像來檢測單個格子的螢光信號進行最後定量。這種單分子酶聯免疫吸附試驗（Digital ELISA）方法具有在100 μL樣品中檢測到少至約 10-20個酶標記的複合物。
Digital ELISA的檢測步驟
Simoa的檢測步驟可分為捕獲、封裝、成像三步（Loading, sealing, and imaging）。
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磁微粒免疫捕獲
使用直徑為2.7微米的磁珠標記特異性抗體。通常而言，一個磁珠上有大約250000個識別位點，保證了識別的效率。將含有500000個標記磁珠加入到100微升樣本中，保證每個磁珠儘可能的只捕獲到一個生物標誌物，並儘可能的把所有標誌物都捕獲到。餘下步驟和普通的磁微粒酶觸化學發光類似，經過清洗和偶聯酶聯抗體形成最後的磁微粒免疫複合物。
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磁微粒的陣列封裝
Simoa使用蝶式晶片的方式將磁微粒進行分裝並利用超靈敏螢光探針對螢光信號進行檢測。這兩部分屬於Quanterix的核心技術。純化後的磁微粒免疫複合物被加入到晶片表面微孔反應室中，由於每個微孔的尺寸（4.25微米寬，3.25微米深）只能容下一個微球，並且被矽油封閉，使得可以使用直接計數或泊松分布公式得到生物標誌物的含量。
Simoa的蝶式晶片具有24路檢測通道，每個通道都含有216000個微孔陣列。通常而言，微孔的數量越多，製造難度和成本也越大，這部分應該也屬於Quanterix的核心技術。
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螢光成像和蛋白定量
圖像的獲取是通過CCD進行成像。通過軟體控制CCD進行長時間曝光獲得明場和螢光照片，從兩幅照片中獲得螢光點佔總顆粒的百分比進而確定生物標誌物濃度。對於更高濃度的生物標誌物，還可以利用CCD採集模擬信號值進行檢測，這種方法大大擴大了其檢測動態範圍。
QUANTERIX簡介
2007年，Walt成立了Quanterix Corporation。公司總部位於美國麻薩諸塞州，規模很小，只有數十名員工。不過，Quanterix自主研發的單分子免疫陣列技術（SiMoA）是目前商業化產品中最靈敏的免疫分析方法，還已經具備多重檢測能力。
Quanterix公司一直致力於數位化的蛋白標誌物研究，推動精準醫療發展。其核心技術是 simoa (single molecular array)，即單分子陣列技術，科學創始人之一是美國工程院和醫學院院士David R. Walt教授（illumina創始人之一）。2017年12月在美國納斯達克上市(nasdaq: qtrx)。
Quanterix推出的儀器都是基於simoa技術，simoa可實現單個分子檢測，靈敏度達到飛克級別（fg/ml），比傳統elisa方法靈敏度高出1000 倍。應用於腫瘤，神經、心血管、感染性疾病和免疫炎症等領域蛋白標誌物檢測，以及mirna檢測。
Walt博士不僅是Quanterix科學顧問委員會的科學創始人和主席，其也是基因測序龍頭企業Illumina的創始人兼董事。他是塔夫茨大學的羅賓遜化學教授和霍華德休斯醫學研究所的教授。Walt博士是美國國家工程院院士，美國科學促進會成員，美國醫學和生物工程研究所研究員。Walt博士是多個期刊的編輯顧問委員會成員，包括分析化學，分析和生物分析化學，傳感器快報和印度生物技術雜誌。
產業化情況
目前Quanterix有多種通量的儀器以滿足不同的應用需求，其中最出名的是Simoa HD-1。具體檢測性能和儀器參數如下所示。
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檢測性能
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儀器參數
目前Simoa的商品化試劑盒已經覆蓋腫瘤、神經、心血管、免疫等。通過Simoa可以直接對血清和血漿中蛋白、miRNA等標誌物進行超高靈敏度檢測，極大的推動腫瘤、神經、感染性疾病和免疫炎症，特別是癌症的早期檢測，術後的檢測和精準用藥。國內杭州紐藍科技有限公司是Quanterix中國區總代理。2018年，佰美基因和Quanterix合作成立佰美-Quanterix中國合作研究中心。
具體的檢測項目如下所示
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