線粒體的提取與觀察

2020-12-06 生物谷

線粒體的提取與觀察

來源：來源網絡 2007-04-10 22:29

線粒體是細胞中重要的細胞器，存在於絕大多數生活細胞中，它的主要功能是提供細胞內各種物質代謝所需要的能量。正由於這樣，對線粒體膜，呼吸鏈酶及線粒體DNA等成分的結構，功能以及物理化學性質的研究已經成為細胞生物學研究中的重要課題，所以提取線粒體的技術已經成為線粒體研究中必不可少的手段，線粒體大量存在於代謝旺盛的細胞中，如動物的心肌，肝，腎等器官和組織的細胞中，大量置備線粒體就是從這些器官組織中提取，當所用樣品較少時（如電鏡和光鏡的觀察）可採用從組織培養細胞中提取，本實驗就是介紹兩種材料製備用於光鏡觀察的線粒體。  

一、目的與要求
了解提取線粒體的基本原理及其過程，通過光學顯微鏡的觀察了解體外分離的線粒體的一般形態  

二、 基本原理
線粒體具有完整的結構，一定的大小和質量，低溫條件下在等滲液中破碎細胞，差速離心後，獲得線粒體。經活性染料Janus green B染色，線粒體呈淺藍色。  

三、實驗內容
1．線粒體的分離提取      2. 鼠肝的勻漿製備      3. 線粒體的活體染色  

四、實驗步驟
（一）動物組織線粒體的分離，提取與觀察

顯微鏡檢查：將1％Janus green B溶液按1:1比例加入線粒體懸液中,在室溫或水浴中染15~20分鐘,用吸管吸取一滴線粒體懸液，滴於載玻片上，加蓋玻片後，放顯微鏡下進行觀察，線粒體為藍綠色圓形顆粒。
2．組織培養細胞的線粒體的提取與觀察

（三）操作中應該注意的問題
1．  整個操作過程為保證線粒體的完整，應儘量使操作時的環境如溫度（0—4℃），pH (7.0左右)保持恆定，同時儘可能短操作時間。
2．  組培細胞消化時要特別小心，防止損失或反覆。（損失指細胞脫落到消化液中）。
3．  勻漿時，所用的介質一定是等滲緩衝液，常用的有0.25 mol/L蔗糖溶液或生理鹽水代替Hank’s液
4．  勻漿次數依照勻漿器的鬆緊而定，次數過少，細胞破損不完全，就會影響線粒體產量。
5．  所以取2/3上清夜用來製備線粒體是為防止細胞碎片過多影響觀察。
6．  整個分離過程，一般最好在30—60分鐘內完成，不宜過長。
  
五、習題
1．  敘述動物細胞線粒體的提取過程及其注意事項。
如何鑑定上述方法提取的最終產物是線粒體？

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