【基本原理】
利用DNA 連接酶把目的DNA 片段和載體DNA 連接在一起，成為一個新的重組分子。目的DNA片段被限制酶消化後其末端只可能有3種形式：
(1)帶有相同的粘性末端：用同一種酶或同尾酶處理可得這樣的末端。由於質粒載體也必須用同樣的酶消化，亦得兩個相同的粘性末端，因此在連接反應中，外源目的基因片段和質粒載體DNA均可能發生自身環化，而且正反兩種連接方向都有。為防止載體DNA 自身環化，在連接前需除去載體分子的5』-P，使之最大限度地抑制載體環化現象。
(2)帶有非互補的粘端：用兩種不同的限制酶進行消化可以產生這樣的末端、一般情況下，常用質粒載體的多克隆位點總能找到若干個不同的酶單酶切位點;用兩種酶分別消化載體和目的DNA後，可將外源目的片段定向克隆到載體上。
(3)帶有平末端：由產生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產生，或由DNA 聚合酶Klenow片段補平3』凹陷，使不相匹配的末端轉變為平端。成功的連接反應需純淨的目的DNA 片段和載體DNA 一般採用插入片段(目的DNA)與載體DNA 分子數比為3～5：1。目的基因比例太多，易產生基因自連後插入載體的多聚體。根據插入片段和載體的分子量大小計算連接反應體系中需要加入的各DNA片段含量，計算公式如下：
【器材】
1.水浴箱
2.Eppendorf 管
3.離心機(上海創賽科技提供E23-TD5F臺式過濾離心機|離心機，商品編號：E23-TD5F-臺)
【試劑】
1.T4 DNA連接酶/10×T4 連接酶緩衝液
2.牛小腸鹼性磷酸酶(CIP)/10×CIP緩衝液
3.0.5mol/L EDTA
【操作步驟】
1.建立下列去磷酸基團的反應體系：
10×CIP 緩衝液2μl
線性化載體(已酶切) 10μl
CIP 1μl
ddH2O 7μl
2.37℃水浴1h。
3.加入2μl 0.5mol/L EDTA, 65℃滅活15min。
4.經酚/氯仿抽提，乙醇沉澱後，TE溶解DNA。
5.在Ep 管中建立連接反應體系：
10×連接緩衝液 2μl
DNA片段(0.2μg) 2μl
線性化的載體DNA(0.1μg) 2μl
T4DNA連接酶1μl
ddH2O 13μl
6.混勻，16℃反應數小時(5-12h)。
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