如何拓展二次離子質譜在生命科學研究中的應用——訪中科院化學所...

　　在2012年以前，汪福意研究員一直帶領團隊通過有機質譜，如電噴霧電離質譜(ESI-MS)、基質輔助雷射解析電離質譜(MALDI-MS)等進行藥物相互作用組學研究、抗腫瘤藥物的研究和開發等工作。一次與生物學家偶然的討論給汪福意帶來了啟發，他萌生了使用高空間解析度的二次離子質譜成像進行化學生物學和分子生物學研究的念頭。中科院化學所領導對於他的想法非常贊成，在中國科學院和國家自然科學基金委的大力支持下，該團隊在2012年購置了一臺飛行時間二次離子質譜(ToF-SIMS)儀，從此汪福意研究員和他的團隊開始了生命科學領域SIMS成像新技術和新方法的研究工作。

　　SIMS與其它質譜相比有什麼特點?SIMS在哪些領域的應用中具有顯著優勢?汪福意團隊用SIMS這個「龐然大物」在生命科學領域進行了哪些研究?國際上的SIMS相關領域有哪些前沿的創新?日前，儀器信息網編輯圍繞二次離子質譜的應用，在中國科學院化學研究所採訪了汪福意研究員。

汪福意研究員

離子源的發展把SIMS帶到了生命科學門口

　　二次離子質譜(Secondary ion mass spectroscopy，SIMS) 的原理是利用聚焦的一次離子束轟擊樣品表面，使樣品中的化學物質濺射產生二次離子，通過質量分析器後進入檢測器記錄離子的荷/質比，獲得樣品表面化學成分的結構信息。配合對樣品表面的掃描和濺射剝離，還可獲得樣品的二維/三維化學成像。SIMS能檢測元素周期表中所有元素及其同位素，質量解析度較高(對29Si的質量解析度大於11000)，檢測限達到ppm到ppb級。SIMS成像的橫向解析度小於100 納米;基於濺射源的性能，縱向解析度可達1 納米。

　　根據一次離子束運行方式和質量分析器的不同，SIMS又分為NanoSIMS和ToF-SIMS。NanoSIMS的質量分析器為單聚焦或雙聚焦磁質量分析器，其一次離子束為單原子或雙原子離子，如Cs+和O2+。聚焦的離子束以連續方式轟擊樣品表面，濺射產生低質量數的離子碎片。基於這些特點，NanoSIMS多用在天體化學、天體年代學、地質沉積學、地礦探測和材料科學，特別是半導體材料研究等領域。顧名思義，ToF-SIMS的質量分析器為飛行時間質量分析器，其一次離子束以脈衝方式轟擊樣品表面，電離能量較為溫和，與NanoSIMS相比，產生的碎片離子具有較高的質量數。ToF-SIMS的一次離子束經歷了長達半個世紀的發展，從早期的Ga+、Aun+ (n = 1 – 5), 到後來更易於聚焦的Bin+ (n = 1, 3), 再到現在的C60+、Arn+ (n 高達4000)等團簇離子。團簇離子源的誕生，使ToF-SIMS 離子化產生的離子的質荷比更高，甚至可獲得大分子量物質的準分子離子。因而SIMS數據包含的結構信息更為豐富，這對複雜生物體系的研究具有非常重要意義。可以說，正是離子源的發展將SIMS帶到了生命科學研究的門口。

　　由日本京都大學教授Jiro Matsuo (松尾次郎)發明的氬氣團簇離子源是SIMS技術領域一個裡程碑式的事件。氬離子團簇包含上千個氬原子，其離子半徑可以通過增加或減少亞原子數目進行調控，最多可達4000個氬原子。氬團簇離子源既可作為濺射源用於生物樣品如細胞和生物組織的濺射剝離，也可作為分析源進行生物樣品的表面分析。因而，配備氬團簇離子源的ToF-SIMS在生命科學研究領域得到越來愈多的青睞。

　　隨著一次離子源團簇離子的直徑變大，SIMS成像的空間解析度也會相應降低。對此，汪福意說：「應用SIMS成像進行生物研究的時候，找到離子碎片大小和空間解析度的平衡非常重要，也就是說在獲得質量數較大的、結構信息豐富的碎片離子的前提下儘量保證質譜成像的空間解析度。」

　　在團簇離子源發明之前，SIMS在生命科學領域的應用受到限制，因為強調生物大分子結構解析的生物學研究無法從SIMS產生的小碎片離子中得到足夠有用的信息。在上個世紀90年代，開始有人嘗試基於SIMS在同位素質譜研究中的優勢，從生物代謝的角度去了解生物合成過程。汪福意提到：「在這方面，哈佛大學醫學院有一支有名的研究團隊，他們自己搭建SIMS裝置，研究的重點就是利用SIMS成像探索生物合成和生物代謝過程，如DNA的合成、複製與轉錄。這種研究不是關注高質量數的離子碎片，只需要獲得N-15和C-13等同位素標記的鹼基碎片在細胞核內的分布信息，就可以分析研究由化學刺激或抑制作用導致的生化過程。」該研究組利用SIMS在細胞生物學前沿領域的研究中取得了很多高影響力的研究成果，對SIMS在生命科學研究領域的應用起到了極大的促進作用。

「強強聯手」，SIMS與顯微技術共締超高分辨細胞成像

　　作為傳統意義上的無機質譜，SIMS與有機質譜都可以應用於生物組織成像研究。「能夠用於組織成像的質譜技術有不少，但並沒有哪類技術能被取代。利用MALDI-MS、DESI-MS等有機質譜技術進行生物組織成像分析比SIMS更快捷和簡單，而SIMS在空間解析度上的優勢是其它質譜成像技術無法超越的。」在介紹不同質譜技術在生物組織成像中的應用和區別時，汪福意說：「SIMS不擅長分析生物大分子，如果想進行多肽、蛋白質或大DNA片段分析，有機質譜是更好的選擇。SIMS的空間解析度很高，即使是用氬團簇離子源也能達到微米、甚至亞微米級的空間解析度，能夠進行單細胞或亞細胞器的成像分析。儀器廠商都在提高質譜成像空間解析度方面下了功夫，但到目前為止還是SIMS成像的空間分辨能力更有優勢。」

　　在研究金屬抗腫瘤候選藥物細胞攝入和分布時，SIMS成像可以通過特徵生物碎片，如磷脂碎片和DNA脫氧核糖碎片指示亞細胞器的位置，進而確定金屬藥物在細胞中的定位和分布。但是，在這些特徵生物碎片離子的信號較弱或其指代的生物信息並不唯一時，僅僅基於SIMS離子信號的藥物亞細胞器定位可能出現誤差。在這種情況下，結合亞細胞器螢光染色的光學顯微鏡成像可以彌補SIMS信號低，不能準確定位的劣勢。常與SIMS結合使用的光學顯微鏡有雷射共聚焦顯微鏡和超高解析度的受激輻射耗盡(Stimulated Emission Depletion，STED)顯微鏡技術。二者的區別在於空間解析度：雷射共聚焦顯微鏡的空間解析度在亞微米級，STED螢光顯微鏡解析度可以達到30納米。

　　通過這種光學顯微鏡成像與SIMS化學成像相結合的方法，汪福意團隊發現他們自主研發的一種有機金屬釕抗腫瘤化合物可同時定位在細胞膜和細胞核上，證實了他們在分子水平上的研究結果，即該化合物可以同時作用於細胞膜上的受體激酶和細胞核內的DNA，具有潛在的雙靶向特性。

　　利用SIMS與光學顯微鏡成像的融合，在完成金屬抗腫瘤化合物在細胞中的分布研究之後，團隊又進行了金屬藥物損傷DNA在細胞內與蛋白質相互識別、相互作用的機理研究。

　　「我們用順鉑等金屬抗腫瘤藥物中的金屬離子指示藥物損傷的DNA，用光學顯微鏡來定位抗體染色或融合螢光蛋白定位DNA結合蛋白。如果光學成像信號與SIMS化學成像信號完全重疊的話，說明它們在細胞水平能相互識別和相互作用。」汪福意表示，這個研究工作能夠證實從分子水平研究獲得的藥物分子作用機制的猜想，「很多人在體外生理模擬環境中做這類研究，但細胞水平上藥物損傷DNA與蛋白質相互識別和相互作用的研究還沒有文獻報導。」目前該工作進展順利，團隊還將繼續研究DNA結合蛋白與藥物損傷DNA的相互識別可能導致的細胞凋亡等生物過程。

　　在用SIMS成像與光學顯微鏡成像聯用，研究細胞內和細胞間生物分子相互識別時，必然需要先後使用兩類儀器尋找、定位樣品板上微小區域內的同一個或幾個單細胞。而在1平方釐米甚至更大面積的樣品板上準確定位同一個微米級的細胞，是個不小的技術難題。為了解決這一制約研究進展的技術問題，汪福意團隊在矽片或玻璃樣品板上以光刻方式刻寫上200微米的方形網格，並給每個格子一個標號，製備了一種簡單、實用的可尋址樣品板。這樣對於相同網格內單個細胞的成像數據進行疊加處理就變得簡便易行。「通過光刻網格定位單細胞僅是一個很小的技術改造，但確實給我們的研究帶來很多方便。」汪福意介紹到。

(圖)ToF-SIMS與共聚焦雷射掃描顯微鏡(CLSM)成像聯用時的可尋址細胞定位

借力微流控技術實現液相反應體系的SIMS實時原位分析

　　SIMS是基於高真空的分析技術，分析室內真空度極高，無法分析液態樣品，生物樣品一般都是採取冷凍乾燥或樹脂包埋等方式處理後再進行SIMS分析。在2010年前，沒有人嘗試過用SIMS分析液體樣品，直到美國太平洋西北國家實驗室的兩位華人科學家朱梓華(Zhu Zihua)和於曉英(Yu Xiaoying) 開始研究真空兼容的微流控技術和裝置。

　　汪福意從2013年初開始與兩位科學家合作，進行基於微流控技術的液相SIMS技術研究。其研發技術的核心是真空兼容微流控裝置，在留有微通道的聚合物基底上嵌入100納米厚度的氮化矽薄膜，兩端連接上微流控管道，通過一次離子束的轟擊可在薄膜上打出2微米的小孔。由於小孔直徑很小，即使在高真空中，液體的表面張力也能將微流控池內的液體限制在小孔內。這時的小孔內液面即為分析表面，用一次離子束轟擊液面濺射出帶電離子，即可進行反應池內化學反應的原位實時分析。

　　由於液體表面可以實時更新，所以該裝置可以測定瞬時反應中間體。在氮化矽薄膜上鍍上一層金屬電極，在反應池內嵌入對電極和參比電極，即可構成三電極電化學反應系統，加上電壓之後，可進行電化學氧化還原反應過程的原位實時檢測。對於液相SIMS分析技術，汪福意評價說：「這樣的分析對研究化學和生物反應很有幫助，能讓我們更深入地了解化學、生物反應過程。實時和原位分析的優勢是能夠捕捉到一些轉瞬即逝的中間產物。」 據了解，國內外都有不少科學家致力於用電噴霧電離(ESI)和解析電噴霧電離(DESI)等質譜技術進行反應中間體研究，而用SIMS進行(電)化學反應過程和中間體研究的團隊相對較少。汪福意團隊還將利用此裝置開展電池的充放電反應和均相或液相催化反應研究。

　　SIMS研究固體樣品，無論是礦物質、材料還是生物質凍幹切片都是分析其最終狀態，而液相SIMS技術讓研究活細胞的生物化學過程，如神經遞質的釋放等成為可能。

增進交流與學科交叉，鋪就SIMS發展之路

　　憑藉超高的空間解析度，發揮在藥物及代謝物成像研究和生物反應中間產物分析中的優勢，SIMS理應在生物研究領域大有作為。然而，國內用於研究的SIMS儀器數量仍然不多，包括地學和材料分析在內也僅有二十多臺。據汪福意分析，目前ToF-SIMS的價格在800萬左右，NanoSIMS的價格更高，價格昂貴是限制其廣泛應用的主要因素。另外，SIMS儀器維護較為複雜，維護費用高，樣品製備等過程對技術要求也比較高，也是制約SIMS廣泛應用的因素。

　　汪福意對今後SIMS的應用發展並不擔憂，他說：「國家在儀器研發和應用研究方面的投入越來越大，相信以後會有更多的實驗室引進SIMS儀器。」 在十二五國家重大科研儀器研製項目中，有兩個項目涉及二次離子質譜，分別為「高分辨多功能化學成像系統」和「同位素地質學專用TOFSIMS科學儀器」。汪福意參加了中科院化學所萬立駿院士領銜的 「高分辨多功能化學成像系統」的研究，負責SIMS和高分辨光學顯微鏡技術聯用成像子系統的研究工作;北京離子探針中心劉敦一研究員領導的 「同位素地質學專用TOFSIMS科學儀器」項目主要研製和開發用於高精度同位素豐度分析的TOFSIMS新技術。

　　我國在二次離子質譜在地球科學領域的應用研究與國際上同類研究的水平相當，在一些領域甚至處於國際領先水平。「但是在生命科學領域的應用研究與國際同行相比仍然有較大的差距，推進SIMS在生命科學研究領域的應用需要國內同行共同努力。」汪福意和其他二次離子質譜領域的專家們在不斷加強與國際SIMS應用研究同行的聯繫與交流。他們把每兩年一屆的國際二次離子質譜大會看作一個讓國內研究學者直接接觸國際前沿SIMS技術的絕佳平臺，在中國物理學會質譜分會等組織的支持下，中國二次離子質譜研究的專家學者們也一直致力於申請該會議的主辦權。

採訪編輯：郭浩楠

　　後記：今年10月「第六屆中國二次離子質譜會議」將在大連舉辦。汪福意研究員是此會議學術委員會的共同主席，他與其他SIMS領域的科學家們共同邀請到一些國際SIMS專家來介紹他們的前沿技術和最新研究成果，與國內研究者們共同探討SIMS技術及應用。正在或有意應用SIMS技術進行科學研究的科學家們希望通過會議或其他各種形式與國內外同行交流、溝通，尋求與其它學科的交叉合作。

　　生命科學領域的科學家可能並不完全了解SIMS技術，也不太清楚SIMS技術能解決生命科學研究中的哪些具體問題;而SIMS分析的研究者也可能不太了解生命科學的研究焦點，彼此存在「背靠背」的窘境。希望更多的科學家能夠了解SIMS技術，實現多領域跨學科合作以解決更多生命科學難題。

附件：汪福意研究員簡歷

　　學習經歷

　　1999年6月 武漢大學化學系畢業，獲理學博士學位

　　1991年6月 華中師範大學化學系畢業，獲理學碩士學位

　　1983年7月 華中師範大學化學系畢業，獲理學學士學位

　　工作經歷

　　2007 – 至今 中國科學院化學研究所「百人計劃」 研究員、課題組長、博士生導師、北京質譜中心主任

　　2002 – 2007 英國愛丁堡大學化學系　英國研究基金會(RCUK) Research Fellow

　　2000 – 2002 英國愛丁堡大學化學系　英國皇家學會皇家獎學金Research Fellow

　　1997 – 1999 華中師範大學分析測試中心　副教授，副主任

　　1991 – 1997 華中師範大學分析測試中心　講師，無機分析部主管

　　1983 – 1988 湖北鹹寧師範高等專科學校　助教，講師

　　學術任職

　　中國物理學會質譜分會常務理事、有機質譜專業委員會委員 (2008.9 – 2012.8)，生物質譜專業委員會副主任委員(2012.8 –)

　　中國生物化學與分子生物學學會蛋白質組專業委員會委員 (2011.4 –)

　　美國化學會會員

　　中國化學會會員

　　國際生物無機化學學會會員