第一作者：Gillian Houlihan
通訊作者：Philipp Holliger
通訊單位：University of Cambridge
1. XNA反轉錄酶聚合活性的定向進化實驗設計和篩選；
2. XNA反轉錄酶保真性定向進化實驗設計和篩選。
反轉錄酶能將RNA轉換成互補DNA，該功能是維持多種生物體正常機能的關鍵步驟。在體外，反轉錄酶被廣泛應用於核酸診斷、RNA測序和核糖體展示等體外領域[1-3]。新的研究表明，一些反轉錄酶能以非天然核酸（XNA）為模板合成互補的DNA，能夠賦予XNA生命特徵[4]，拓展XNA在合成基因學和分子生物學領域的功能。然而，目前的反轉錄酶僅對少部分XNA有轉錄活性，且活性低，絕大多數XNA沒有反轉錄酶。基於此，本文針對設計了一種普適性的反轉錄酶定向進化篩選平臺（CBL），通過對母體聚合酶進行進化，獲得理想的XNA轉錄酶。結果表明，利用RT521K作為反轉錄酶的母體，可以獲得多種具有高活性XNA的反轉錄酶。將該平臺進行改進後，也可再次實現反轉錄酶的保真性定向進化。
對於反轉錄酶定向進化技術而言，將表達基因和表達產物對應是設計定向進化平臺的關鍵。本文通過微球標記的方式，分別實現了反轉錄酶活性測試和對反轉錄酶表達基因進行捕獲，從而實現基因型和表現型的對應。該系統（CBL）對反轉錄酶的篩選過程如圖1a。通過對母體聚合酶（RT521K）的核酸結合區域和緩解空間位阻的區域（Library P）進行多次定向進化後，得到多個反轉錄酶。結果顯示RT-C8反轉錄酶對於2』-O-Me RNA具有最高活性，遠高於目前商品化的RTx和SSIII（圖1b）。RT-H4和RT-TKK分別對HNA和AtNA具有較高的反轉活性（圖1c和1d），而在此之前沒有相應XNA的反轉錄酶報導。此外，作者發現RT-C8對用於治療脊肌萎縮症的PS 2′-mOe RNA也具有較高的反轉錄活性。
圖1 a 反轉錄酶定向進化流程；b 2-O-Me-RNA反轉錄分析；c HNA反轉錄分析；d AtNA反轉錄分析。
要點2. 反轉錄酶保真性定向進化實驗
反轉錄的保真性也是評價反轉錄酶的一個重要指標，實驗結果表明恢復RT-C8的外切酶活性（3』→5』）可有效提高其反轉錄的保真性。除此之外，本文也嘗試對CBL平臺進行改進（圖2a和2b），通過定向進化的方式提高反轉錄酶的保真性。隨後對RT521K的核苷酸結合的區域（Library HF）進行定向進化，成功篩選出了具有高保真性的反轉錄酶RT-H11和RT-TR（圖2e和2f）。相對於進化母體（RT521K），RT-H11和RT-TR的保真度提高了200多倍，比商品化的M-MuLV和SSIII也高出數十倍。
圖2 高保真度反轉錄酶定向進化：a，b 高保真反轉錄酶篩選策略；c 反轉錄酶序列對比；d 核苷酸結合區域突變示意圖；e 反轉錄酶保真性對比；f 平均誤差頻率。
本文基於微球的僑聯作用，構建了一種能夠定向進化反轉錄酶的平臺。該平臺解決了基因型和表現型的難以完全對應的問題。後續試驗表明，該平臺不僅可以實現反轉錄酶活性的定向進化，也可以對其保證性進行定向進化，是一種適用於轉錄酶進行定向進化的普適平臺。
https://www.nature.com/articles/s41557-020-0502-8
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李顯明（xianming_li@sina.cn）
吳鵬課題組博士研究生