玩轉qPCR系列 | 反轉錄——第一道關口(1)

2021-01-16 教你玩轉qPCR

       上一期的關注點是核酸樣本的質控，質控評估合格之後，接下來要進入到qRT-PCR實驗中極其關鍵的第一個反應——反轉錄，也是本期要討論的部分。

       反轉錄反應的描述很簡單，就是RNA轉化變成complementary DNA(cDNA)的過程。然而，這個過程相對DNA複製反應更複雜，涉及更多的組分。事實上，在整個實驗的variation中，反轉錄過程佔據了相當大的比重；因此要做好基因表達實驗，這個過程的很多細節都要研究透。

       接下來會從反轉錄酶、RNA的量、mRNA靶點位置、引物策略、反應條件及樣本保存這幾個維度展開。

 

反轉錄酶

       目前市面上的反轉錄酶絕大部分來自於莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)和禽成髓細胞瘤病毒(AMV)，當然或多或少的都經過了改造。不同的酶具有不同的功能活性，適合不同類型的RNA模板，比如高GC含量的或者富含二級結構的。另外，有的會附帶RNase H活性，能夠切割mRNA：cDNA雜交鏈中的mRNA，提高後續qPCR檢測的靈敏度；也有的工程酶特意將其失活，從而可以得到更長的cDNA產物，適合長片段基因的克隆表達，但對qPCR反應可能意義不大，因為qPCR的產物長度一般控制在200 bp以內，並不需要這麼長的轉錄物。

       評價哪一款反轉錄酶最適合你的實驗，要從產量、重複性和線性範圍幾個方面進行考量。建議先測試3-4款反轉錄酶，最好是不同廠家的，且各有特點。每一種反轉錄酶做3-4個技術重複，靶標基因和內參基因都要測試，其他反應條件均保持一致，如引物策略、溫度和後續的qPCR反應等，最後比較MeanCq和SDCq的大小。假定測試了8種反轉錄酶和6個基因，其中β-actin和GAPDH為內參基因，其餘4個為內參基因，結果如Fig1所示。綜合來看，代號為Super的酶產量最高，AMV最差；重複性上表現都比較相近，除了HTR2a基因，這可能是由於本身表達量很低造成的[1]。因此在該實驗的最佳選擇就是Super酶。最後，文章方法中應註明使用的酶的名稱、廠家和工作濃度。

Figure 1. 8種反轉錄酶的產量及重複性測試[1].

        每種酶對應的工作線性範圍千差萬別，而了解線性範圍會使我們對RNA的加樣量更有信心。通常做法是從一個高濃度賦值樣本出發，稀釋5-6個點，每次4-5倍，每個點3-4個重複。比如從1000 ng/μl到1 ng/μl，從擬合的標準曲線中挑取R2值最大且範圍也較廣的所對應的反轉錄酶。R2值是需要優先保證的，適當的捨棄極端濃度點會提高R2值。值得注意的是，稀釋介質不能用水，需要用核酸介質（如不同物種的tRNA）來保證每個稀釋梯度的總RNA濃度是一致的，這是因為用水來做稀釋會導致標準曲線線性擬合效果很差(Fig 2)[2]。

Figure 2. 總RNA分別使用水和酵母tRNA稀釋做出的五個基因表達量的標準曲線[2].

RNA的量

       如果要做的靶標基因數量很多，那一次反轉錄中要多加一些RNA，但也不要超過線性範圍的上限，獲得的cDNA樣本取一小部分進行後續試驗(稀釋與否視基因表達豐度高低而定)。如果採取一步法，也就是反轉錄與qPCR在同一個體系中完成，那RNA的加樣量就要根據預估的基因表達豐度來定，在滿足線性範圍及」RNA原料充足「的前提下，適當多加一些可以提高數據的精密度[3]。無論最後確定加入多少RNA，建議所有樣本都要參照實行，這樣可以提高數據的可比性。

mRNA靶點位置

       做基因表達實驗時，更推薦在mRNA的3』端附近設計擴增片段，尤其是採用Oligo dT作為反轉錄引物(下一期會討論引物策略)時。通常會期望反轉錄時能夠將全長的RNA片段都轉化成cDNA，但實際上這是不現實的。當mRNA很長時，反轉錄酶往往走不到5』端就會掉落，這跟普通的DNA Taq酶很難克隆擴增長片段是一個道理。然而，有時在3』端設計擴增片段是不合適的，這時需要衡量反轉錄的長度及mRNA完整性。通過在兩端分別設計擴增位點來比較Cq的差異，就可以對cDNA的完整程度有一個大概的把握（Fig 3）[3]。最後，無論使用哪種引物策略，都推薦做一下不同擴增位置的對比試驗，以免其帶來的誤差導致數據的偏倚。

Figure 3. 不同擴增位置對結果的影響[3]。 RS和V是兩種反

轉錄酶。

       下一期討論剩下的引物策略、反應條件和保存等因素。

 

參考文獻

1.  Ståhlberg,Anders, Mikael Kubista, and Michael Pfaffl. "Comparison of reversetranscriptases in gene expression analysis." Clinical chemistry 50.9 (2004):1678-1680.

2.   Ståhlberg,Anders, et al. "Properties of the reverse transcription reaction in mRNAquantification." Clinical chemistry 50.3 (2004): 509-515.

3.   Bustin,Stephen, et al. "Variability of the reverse transcription step: practicalimplications." Clinical Chemistry 61.1 (2015): 202-212.


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