本期討論反轉錄反應中引物策略、反應條件及樣本保存三個要素。
引物策略
反轉錄酶與DNA聚合酶一樣，都需要「引子」來啟始反應。反轉錄反應中使用的引物分為三種類型：Oligo dT、隨機引物和特異性引物，需要根據實驗類型與需求靈活選擇。
Oligo dT是由一系列重複T鹼基組成的寡核苷酸單鏈，長度一般在15-20 nt，常用的是16或者18，寫作Oligo dT16和Oligo dT18。這種類型的引物適合真核生物的mRNA反轉錄，因為其後面有長長的poly A尾巴，但對於tRNA、rRNA以及原核生物的RNA是無能為力的。同時，由於是反轉錄的起始位點都在mRNA末端，如mRNA很長可能無法生成完整的cDNA鏈，因此要求PCR擴增位點儘可能設置在末端。對於新手而言，最先接觸到的也是最常用的應該就是Oligo dT，但很多時候也存在濫用的情況。
隨機引物是一系列不同引物的混合體，每個鹼基位置都有四種可能的選擇，長度一般是6 nt或者8nt，即便長度很短，其引物的種類數量也是驚人的。隨機引物的優勢就在於隨機性和種類數量龐大，適用於所有類型的RNA，尤其是當靶標RNA豐度很低或者存在二級結構時，隨機引物的優勢更為明顯。使用隨機引物要注意的是加量，每5 μg總RNA一般推薦50-100 ng的用量，加入太多會出現小片段產物過多，長片段產物過少。
特異性引物也就是下遊qPCR反應用到的一對引物，同樣也可用於啟始反轉錄反應，只產生需要的cDNA，因此能夠保證後續的qPCR反應更特異。但有時候，僅靠特異性引物無法有效的引導cDNA合成，效率太低，因此不得不選擇前面兩種引物類型。
Figure 1. 三種引物策略的示意圖
不同的引物策略當然會導致不同的cDNA構成，進而影響Cq值；同樣的，適用於所有實驗條件的引物策略也是不存在的，因此在正式實驗前也要評估不同引物策略的啟始效率。如Tab. 2所示，五個靶點採用不同的引物策略得到的Cq值是有差異的，Glut2基因甚至能查到4個循環以上；從cDNA產量角度評價，β-tubulin及Insulin II宜採用Oligo dT，CaV1D和GAPDH宜採用隨機引物[1]。
如果採用一步法，那只能選擇特異性引物進行反轉錄；如果採用兩步法，那三種引物策略都可以使用，一般更推薦Oligo dT和隨機引物混合使用，可以使mRNA各部分都以相同效率進行反轉錄，提高下遊qPCR數據的重複性。最後，方法中要備註採用的引物策略及使用量。
反應條件
這裡的反應條件指反轉錄體系的組分構成、反應溫度和反應時間。反應溫度要看使用的反轉錄酶的最大活性(一般42℃-50℃)，反應時間要參考RNA的加量。如果使用反轉錄試劑盒，一般參照說明書來進行設置。
樣本保存
無論是保存RNA還是cDNA樣本，一定要避免反覆凍融，建議分裝成合適體積後再保存；RNA樣本容易降解，必須要凍於-80℃，且不要超過3個月。即便這樣，也並不能保證沒有降解，復甦後仍然要對RNA完整性進行評估；另外，保存溶液最好選用商品化的storagebuffer，或者用乙醇/異丙醇沉澱的形式保存，效果會更好。cDNA則要穩定得多，保存於-20℃即可，但也不要超過6個月，如要保存更長時間，儘量保存於-80℃。
下一期討論下遊qPCR的靶點信息，這同樣會對實驗的重複性造成影響。
參考文獻
1. Ståhlberg,Anders, et al. "Properties of the reverse transcription reaction in mRNAquantification." Clinical chemistry 50.3 (2004): 509-515.