吐血整理外泌體標記方法(附原文)

2020-12-06 生物谷


小編推薦會議：2018外泌體技術與應用論壇

 

 

Exosome（外泌體）是由活細胞分泌的直徑約為30-150 nm的小囊泡，具有典型的脂質雙分子層結構；參與細胞之間的交流，物質的運輸以及正常生理過程的維持，此外還與疾病的產生有關。

對分離的外泌體進行體外標記或活體示蹤，有助於對外泌體的功能進行進一步的研究。目前對於外泌體的標記方法有很多種，包括親脂性的染料和膜滲透型的化合物等。

下面小編就為大家羅列下近幾年文獻發表中有關外泌體染色的方法。

1

親脂性染料：

PKH-67（green）/PKH-26（red）

染料可以穩定的與細胞膜脂質區結合併發出螢光，主要用於細胞體外標記、體外細胞增殖研究以及體內外的細胞示蹤研究。PKH67的體內螢光半衰期為10-12天。相比於PKH-67，PKH-26具有更長的半衰期，標記在兔紅細胞上的PKH26半衰期長達100天以上。特別適用於體外增殖研究以及長期的體內細胞跟蹤研究。

將PKH67標記的神經細胞外泌體與b.End3 細胞共培養後的螢光圖（圖片引自：Xu B， Zhang Y， Du X-F， et al. Neurons secrete miR-132-containing exosomes to regulate brain vascular integrity. Cell Research. 2017；27(7)：882-897.

2

親脂性羰花青染料

（carbocyanine dyes）：DiI/DiD/DiO/DiR

DiI， DiO， DiD， DiR是一系列親脂性的螢光染料，可以用來染細胞膜和其它脂溶性生物結構。這些環境敏感性螢光染料在進入細胞膜之前螢光非常弱，當與細胞膜結合後其螢光強度大大增強。且具有消光係數高、極性依賴性、激發態壽命短等特點。一旦進入細胞膜後，可在整個細胞膜上擴散，最佳濃度時可以使整個細胞膜染色。

下面小編整理了使用這類染料對外泌體進行標記的文獻。

DiI

將DiI標記的外泌體注射入小鼠海馬齒狀回（DG）區，分別觀察第3、6和20天的螢光結果，對比可以發現外泌體在皮質層發生了很大的遷移。（圖片引自：Zheng T， Pu J， Chen Y， et al. Plasma Exosomes Spread and Cluster Around β-Amyloid Plaques in an Animal Model of Alzheimer’s Disease. Frontiers in Aging Neuroscience. 2017；9：12.）

DiD

DiR

體內靜脈注射DiR標記的外泌體，24H後進行成像觀察，結果如上圖所示。（圖片引自：Wiklander OP， Nordin JZ， O'Loughlin A， et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source， route of administration and targeting.J Extracell Vesicles. 2015 Apr 20；4：26316.）

DiO

使用ExoChip-chambers捕獲不同樣品中的exosome，然後使用DiO進行外泌體染色，通過觀察螢光的強弱對不同來源樣品中的外泌體進行定量分析。（圖片引自：Kanwar SS， Dunlay CJ， Simeone DM， Nagrath S. Microfluidic device (ExoChip) for On-Chip isolation， quantification and characterization of circulating exosomes. Lab on a chip. 2014；14(11)：1891-1900. ）

3

滲透型的化合物標記法：

CFSE/CFDA/Calcein-AM

CFSE

羧基螢光素二醋酸鹽琥珀醯亞胺酯（英文 ，CFSE），可被動擴散進入細胞。 試劑本不具螢光，直至細胞內的酯酶去除其醋酸鹽基團，產生能發出明亮螢光的羧基螢光素琥珀醯亞胺酯。 琥珀醯亞胺酯與細胞內氨基反應，形成穩定且能用醛類固定的螢光偶聯物。

使用CFSE進行標記的外泌體可以用於後續FACS、NTA和顯微鏡觀察使用。（圖片引自：van der Vlist EJ1， Nolte-'t Hoen EN， Stoorvogel W， et.al.Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry，Nat Protoc.2012 Jun 14；7(7)：1311-26.Nat Protoc）

Calcein-AM

在傳統的Calcein（鈣黃綠素）基礎上引入乙醯甲氧基甲酯（AM）基團，增加了疏水性，使其能夠輕易穿透活細胞膜。一旦進入細胞後，Calcein-AM（本身不發螢光）被細胞內的酯酶剪切形成具有膜非滲透性的極性分子Calcein，從而被滯留在細胞內並發出強綠色螢光。

4

利用外泌體表面的巰基（thiol group）

對外泌體進行標記：

5

通過物理的方法對外泌體進行標記：

放射性標記物：99mTc-HMPAO

量子點微囊泡標記：Ag2Se @錳量子點

Ag2Se @錳量子點一體化具有優良的近紅外（NIR）螢光和磁共振（MR）成像能力，可用於MV體內的高解析度雙模式實時有效的標記跟蹤。是一種低毒、高靈敏、非侵入性的實時活體成像的方法。

Ag2Se @錳量子點是通過控制Mn+與Ag2Se納米晶體在80℃的NaOH溶液反應製成，其具有約1.8納米的超小尺寸，良好的水分散性，高NIR螢光量子產率和12.87毫-1-1高縱向弛豫。超小尺寸使他們能夠通過電穿孔直接和有效地裝入的MV。該方法可以用於不同來源的微囊泡標記，對微囊泡的不會有太多損傷。(生物谷Bioon.com）

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