綜述:細胞外泌體顆粒表徵測量技術新進展

　　外泌體最早發現於體外培養的綿羊紅細胞上清液中，是細胞主動分泌的大小較為均一，直徑為40~100納米，密度1.10~1.18 g/ml的囊泡樣小體。

　　細胞外泌體攜帶多種蛋白質、mRNA、miRNA，參與細胞通訊、細胞遷移、血管新生和腫瘤細胞生長等過程並且有可能成為藥物的天然載體，應用於臨床治療。然而，測量技術手段的局限限制了外泌體在這些領域的研究進展。所以，在這篇文章中，總結了外泌體的純化方法，比較了現存各種外泌體測量技術，重點介紹了一種新的測量技術，納米微粒追蹤分析術，在外泌體尺寸和表徵研究中的應用。

　　1. 外泌體提取及方法學評價

　　到目前為止，仍沒有一種方法能同時保證外泌體的含量、純度、生物活性。

　　1.1 離心法

　　這是目前外泌體提取最常用的方法。簡單來說，收集細胞培養液以後依次在300 g、2 000 g、10 000 g離心去除細胞碎片和大分子蛋白質，最後100 000 g離心得到外泌體。此種方法得到的外泌體量多，但是純度不足，電鏡鑑定時發現外泌體聚集成塊，由於微泡和外泌體沒有非常統一的鑑定標準，也有一些研究認為此種方法得到的是微泡不是外泌體。

　　1.2 過濾離心

　　過濾離心是利用不同截留相對分子質量(MWCO)的超濾膜離心分離外泌體。截留相對分子質量是指能自由通過某種有孔材料的分子中最大分子的相對分子質量。外泌體是一個囊狀小體，相對分子質量大於一般蛋白質，因此選擇不同大小的MWCO膜可使外泌體與其他大分子物質分離。這種操作簡單、省時，不影響外泌體的生物活性，但同樣存在純度不足的問題。

　　1.3 密度梯度離心法

　　密度梯度離心是將樣本和梯度材料一起超速離心，樣品中的不同組分沉降到各自的等密度區，分為連續和不連續梯度離心法。用於密度梯度離心法的介質要求對細胞無毒，在高濃度時粘度不高且易將pH調至中性。實驗中常用蔗糖密度梯度離心法，在離心法的基礎上，預先將兩種濃度蔗糖溶液(如2.5 M 和0.25 M)配成連續梯度體系置於超速離心管中，樣本鋪在蔗糖溶液上，100 000 g離心16 h，外泌體會沉降到等密度區(1.10~1.18 g/ml)。用此種方法分離到的外泌體純度高，但是前期準備工作繁雜，耗時，量少。

　　1.4 免疫磁珠法

　　免疫磁珠是包被有單克隆抗體的球型磁性微粒，可特異性地與靶物質結合。同樣，在離心法的基礎上，預先使磁珠包被針對外泌體相關抗原的抗體(如CD9、CD63、Alix)與外泌體共同孵育，蒸餾水衝洗後，重懸於PBS緩衝液中。這種方法可以保證外泌體形態的完整，特異性高、操作簡單、不需要昂貴的儀器設備, 但是非中性pH和非生理性鹽濃度會影響外泌體生物活性，不便進行下一步的實驗。

　　1.5 色譜法

　　色譜法是利用根據凝膠孔隙的孔徑大小與樣品分子尺寸的相對關係而對溶質進行分離的分析方法。樣品中大分子不能進入凝膠孔，只能沿多孔凝膠粒子之間的空隙通過色譜柱，首先被流動相洗脫出來;小分子可進入凝膠中絕大部分孔洞，在柱中受到更強地滯留，更慢地被洗脫出。分離到的外泌體在電鏡下大小均一，但是需要特殊的設備，應用不廣泛。

　　2. 外泌體測量各種方法的比較

　　2.1 電子顯微鏡

　　掃描電子顯微鏡(SEM)的工作原理是以能量為1-30KV間的電子束，以光柵狀掃描方式照射到被分析試樣的表面上，利用入射電子和試樣表面物質相互作用所產生的二次電子和背散射電子成象，獲得試樣表面微觀組織結構和形貌信息。高的解析度。由於超高真空技術的發展，場發射電子槍的應用得到普及，現代先進的掃描電鏡的解析度已經達到1納米左右，足夠用來進行外泌體尺寸的測量。鑑於SEM的工作特點，在外泌體研究中，能夠直接觀察到樣品中外泌體的形態。並且SEM具有很高的解析度，能夠鑑別不同大小不一的外泌體。但SEM對樣品的預處理和製備上面要求較高，樣品的準備階段比較複雜，不適合對外泌體進行大量快速的測量。而且由於外泌體經過了預處理和製備過程，無法準確的進行外泌體濃度的測量。

　　2.2 動態光散射技術

　　動態光散射是收集溶液中做布朗運動的顆粒散射光強度起伏的變化，通過相關器將光強的波動轉化為相關曲線，從而得到光強波動的速度，計算出粒子的擴散速度信息和粒子的粒徑。小顆粒樣品的布朗運動速度快，光強波動較快，相關曲線衰減較快，大顆粒反之(圖1)。

　　

圖1 大顆粒和小顆粒光強波動及相關曲線

　　在外泌體研究中，動態光散射測量敏感度較高，測量下限為10納米。相對於SEM技術來說，樣品製備簡單，只需要簡單的過濾，測量速度較快。但是動態光散射技術由於是測量光強的波動數據，所以大顆粒的光強波動信號會掩蓋較小顆粒的光強波動信號，所以動態光散射不適合大小不一的複雜外泌體樣本的測量，只適合通過色譜法製備的大小均一的外泌體的尺寸測量，並且無法測量樣品中外泌體的濃度。

　　2.3 納米微粒追蹤分析術

　　納米微粒追蹤分析術(以下簡稱NTA)是一種比較新穎的研究納米顆粒的方法，它可以直接和實時的觀測納米顆粒。NTA通過光學顯微鏡收集納米顆粒的散射光信號，拍攝一段納米顆粒在溶液中做布朗運動的影像，對每個顆粒的布朗運動進行追蹤和分析，從而計算出納米顆粒的流體力學半徑和濃度。

　　NTA系統的工作原理是將一束能量集中的雷射穿過玻璃稜鏡對樣品(懸浮顆粒的溶液)進行照射(光路圖見圖2)。

圖2 NTA雷射光路圖

　　

　　雷射光束從較小角度入射進入樣品溶液，照亮溶液中的顆粒。配備相機的光學顯微鏡，被放置在特定的位置上，收集視野中被照亮的納米顆粒發射出的光散射信號。 樣品池有大約500微米的深度，採樣點雷射照亮寬度為20微米，這個數值和光學顯微鏡的聚焦的視野深度相匹配。相機會進行60秒的影像拍攝，每秒30個採樣畫面。顆粒的運動過程被NTA軟體進行分析。NTA軟體在每幅被記錄的畫面中鑑別和追蹤做布朗運動的納米顆粒。

　　根據顆粒的運動速度，通過二維 Stokes-Einstein方程計算顆粒流體力學半徑

　　在方程中2是均方位移，K_B是Boltzmann常數; T是溶液的溫度，單位是Kelvin；t_s是採樣時間，例如，1/30 fpsec = 33 msec；η是溶液粘度；dh是流體力學直徑。 NTA檢測顆粒大小的範圍和顆粒本身的折光指數相關。測量的下限取決於被研究顆粒和背景之間信噪比，也就是顆粒的散射光強度和背景的光強差距。顆粒的散射光強度根據Rayleigh散射方程，受到以下因素的影響

 

　　其中，d是顆粒的直徑，λ是入射光的波長，n是顆粒和溶液的折光係數比。通常來說，生物樣品，如外泌體等，折光係數較低，所以測量下限為30-40納米。

　　由於NTA技術是直接追蹤樣品中每一個納米顆粒，決定了NTA對複雜的樣品具有極高的解析度，為了證明NTA對於複雜樣品的分辨能力，我們將100納米和300納米兩種不同大小的聚苯乙烯顆粒按照5:1的數量混合，使用NTA進行測量(圖3A)。儘管其分布圖形有一定的重疊，但兩種不同大小的納米顆粒的峰清楚的區分開來。這種對複雜樣品的分辨能力對於外泌體這樣的研究對象來說是非常重要的。

　　NTA也能對樣品濃度進行直接測量。對一系列濃度為1×10⁸-8×10⁸的100納米單分散樣品進行測量，可以看到NTA測量濃度結果和實際濃度存在著很好的線性相關(圖3B)。對於多分散體系，測量結果的準確取決於儀器參數的設定(照相機快門速度和光圈)，恰當的參數設定可以保證不同大小顆粒都被NTA軟體追蹤和計算。

圖3 A. 100納米和300納米混合樣品NTA測量 B. NTA測量濃度和樣品實際濃度線性相關

　　NTA還具有分析螢光樣品的能力，NTA有四種不同波長405納米, 488納米, 532納米和635納米的雷射器可以選擇，在搭配相應的濾光片，從而實現對螢光樣品的測量。將100納米的螢光標記的顆粒和200納米的非螢光顆粒用同一溶劑做成混合樣品，使用NTA進行測量(圖4)，圖4中，藍色的線顯示為NTA的光散射模式，可以看到儘管100納米和200nm納米顆粒的分布圖有重疊，但還是清楚的區分了100納米和200納米的峰值。然後使用螢光濾光片進行分析，只觀測到100納米的螢光標記的納米顆粒(紅線)

 

圖4 NTA螢光樣品測量

　　由於外泌體表面有標誌物CD9，CD63等跨膜分子的存在，在複雜的背景環境下(如血清中)，可以用螢光抗體標記外泌體，在用NTA的螢光測量功能實現在複雜背景下對外泌體的測量。NTA相比較於流式細胞儀的螢光功能，解析度較高，測量螢光顆粒的下限可以達到30-40納米，而流式細胞儀的測量下限為400納米，即使對於最新一代的數碼流式細胞儀，其測量下限已經達到100納米，但由於它仍然建立在監測光信號的基礎上，所以測量和準確性和解析度仍然不可靠。所以在外泌體螢光功能測量上，NTA具有獨特的優勢。

　　3. 總結

　　外泌體作為生物標誌物的研究目前處於起步階段，但臨床應用已顯示出良好的前景。 在臨床診斷中，簡單快速的在複雜的生物背景下(如血漿，尿液)測量外泌體濃度，大小和表徵數據是必備的要求。目前存在的方法都無法完美的解決這一問題。NTA作為一個相對新的測量技術，具有實時觀測，較高的解析度，準確的濃度測量和螢光測量功能，提供了對外泌體大小和濃度研究的新的思路。

　　(作者：張帥，英國馬爾文儀器公司生物科學專家，負責生命科學相關產品的推廣與技術支持。)

　　註：文中觀點不代表本網立場，僅供讀者參考。