「自然展望-細胞外RNA」增刊

原文作者：Amanda Keener

研究人員利用天然的細胞外囊泡網絡提供RNA療法。

來源：David Parkins

2008年，Lydia Alvarez-Erviti開始在英國牛津大學做博士後研究，她當時的研究目標是開發出針對神經退行性疾病的基因療法。她將α-突觸核蛋白作為標靶，這是一種在帕金森病患者大腦中積累的蛋白質，並且設計了小幹擾RNA（siRNA）以減少小鼠體內產生的α-突觸核蛋白。但是，她需要能將siRNA導入大腦的方法。該方法既要保護RNA穿越循環血液與大腦之間的屏障，又要安全到可以重複使用。幸運的是，一位同事恰好在研究天然存在的外泌體，這種納米大小的囊泡可能對Lydia的研究有幫助。

外泌體是直徑30到100納米的脂質球體，被全身細胞用來轉移microRNA（miRNA）之類的小分子。外泌體可以在人體內自由通行，而不引起免疫系統的過度關注，每一個外泌體都是「一個理想的藥物載體」，北卡羅來納大學教堂山分校的生物工程師Juliane Nguyen說。

大約十年前，現在任職於西班牙拉裡奧哈省生物醫學研究中心的Alvarez-Erviti和她的同事在帕金森病小鼠模型中證明了外泌體作為藥物載體的潛力[1]。現在，大量動物實驗以及早期人體實驗都證明了外泌體產品的有效性和安全性。

從其他類型的細胞外囊泡（EV）中分離外泌體非常昂貴，並且分離出的外泌體天然攜帶多種未經表徵的物質。從安全性和標準化角度來說，這種複雜性使基於外泌體的療法介於細胞療法和小分子藥物療法之間。不過，這些挑戰並沒有阻止Alvarez-Erviti的團隊或其他致力於將EV標準化和產品化並用於人體的研究團隊和企業。她說：「當你的研究對象是外泌體時，你必須要有很強的決心。」

天然替代物

對於RNA和小分子藥物而言，如何進入細胞內部是抵達靶標的主要瓶頸。人體會採取適當的措施防止異物進入細胞，比如細胞膜和RNA降解酶。為此，生物技術專家想出了各種解決辦法，比如用合成的納米顆粒載體或空載病毒保護藥物不被降解，促進其進入細胞。其中最受歡迎的載體是一種被稱為脂質體的脂質分子球，直徑一般在100到200納米，可以與細胞膜融合來運送其內含物。但是，高劑量的脂質體會破壞細胞，並且脂質體和病毒載體在重複給藥後都會觸發免疫反應。這些問題導致許多研究人員把目光投向了外泌體——這種載體本身就在人體內執行運輸RNA的任務。

通常認為外泌體比人工囊泡更安全，因為它們原本就在體內循環。研究人員發現，在實驗室中用外泌體處理細胞不會引起細胞死亡，並且可以將外泌體反覆注射給小鼠而不會引起炎症反應[2]。Alvarez-Erviti從未成熟的免疫細胞中獲取外泌體，因為這些細胞的囊泡表面沒有免疫激活分子。來自間充質幹細胞的外泌體也很受歡迎，因為幹細胞通常可以躲過免疫系統的監測。

生物工程師Ke Cheng發現外泌體會對它們的來源組織表現出親和力。來源：NC State University/Becky Kirkland

與大多數納米粒藥物載體一樣，外泌體主要在肝、肺和脾臟中累積。但是外泌體也會對它們的來源組織表現出親和力。北卡羅來納州立大學羅利分校的生物工程師Ke Cheng發現，將從纖維肉瘤細胞中獲取的外泌體注射到荷瘤小鼠體內後，這些囊泡會被吸引到腫瘤上[3]。

這種歸巢特性意味著外泌體可以將更多藥物運送到需要的地方，降低了產生副作用的可能性。Cheng的研究小組報告說，將基於脂質體的化療藥物阿黴素裝載到癌細胞外泌體中，可以增加到達腫瘤的藥物量。用外泌體包裹的阿黴素也比單獨使用阿黴素能更大程度地縮小腫瘤。

來自非癌細胞的囊泡也具有重要的歸巢能力。據雅典喬治亞大學幹細胞生物學家、生物技術公司Aruna Bio的共同創始人Steven Stice說，來自人類神經元幹細胞系AB126的外泌體可以穿過血腦屏障，進入受傷部位。一些研究人員正在改造外泌體，以增強它們停留在某些組織中的能力。例如Alvarez-Erviti的研究小組對細胞進行了基因工程改造，以產生表面上帶有狂犬病病毒蛋白的外泌體，這會導致外泌體在腦內存在該蛋白受體的位置聚積。

能將囊泡引導至目標組織的肽也可以與外泌體表面蛋白發生化學連接或將其嵌入囊泡的膜中，這種方法可以加快其在臨床應用中的製備。例如，Cheng的團隊使用一種市售的磷脂試劑將已知會歸巢心臟細胞的肽嵌入外泌體膜中。這增加了外泌體在被誘導心臟病的大鼠心臟中的聚積[4]。

控制內含物

當Alvarez-Erviti開始研究外泌體時，她已經有了一種起治療作用的分子供外泌體攜帶。但是EV中天然充滿蛋白質、RNA和脂質。儘管這些物質的生物活性基本未被表徵，但有些似乎本身就具有治療作用。

研究人員正在努力確定外泌體內的治療活性分子，並將其用於新的治療方法中。Cheng的研究小組發現了一種被稱為miRNA-21-5p的人類外泌體分子，可降低小鼠心臟病發作後的心肌細胞死亡率，並促進血管生成和組織修復。該小組的長期目標是生產具有高濃度miRNA和帶有歸巢心肌細胞能力的肽的外泌體。這些被Cheng稱為超外泌體的外泌體可以在心臟病發作後立即通過血液給藥。

用EV裝載藥物的一種方法是用電流或化學物質破壞囊泡膜，使藥物進入。另一個方法是對產生囊泡的細胞進行基因工程改造，使其在形成囊泡前就製造RNA或蛋白質藥物。但是，尚無法保證經基因工程改造的細胞會將所需的物質裝載到其囊泡中。加州大學歐文分校的生物醫學和材料科學家Young Kwon說：「細胞會自己決定要封裝哪些物質。」

Nguyen的小組正在研究細胞是如何做出這些決定的，以尋求提高外泌體裝載人工物質的方法。研究人員已經確定了天然外泌體RNA中常見的、可能在包裝分子中起作用的編碼鏈。Nguyen發現將其中一些分子密碼複製到其他RNA上會使它們在外泌體中的裝載量增加多達100倍。她計劃使用該技術為乳腺癌細胞外泌體裝載能抑制血管生成和癌症擴散的miRNA。

另一種控制囊泡內含物的方法是通過對細胞進行物理或化學處理來迫使它們形成。Kwon的研究小組通過化學方法誘使細胞夾斷其本身的膜結合小泡，這種小泡與天然存在的EV相比，其大小和內含物更均勻，因為細胞產生的任何RNA將隨機分配到小泡中。通過這種方式，細胞可以在數小時內而不是數天之內產生數量為天然EV十倍的小泡[5]。

新型生物製劑

EV必須來源於活細胞，這是EV具有諸多優勢的原因，但也為其開發成商業化產品帶來了諸多挑戰。大多數企業都使用一些特徵明確的細胞系來生產所有的外泌體。幹細胞自然是一種選擇，因為它們可以培養很長時間，並且不會產生免疫反應。瑞典哥德堡大學研究外泌體的Jan Lötvall說，比起在平坦表面上培養，懸浮培養的細胞能產生最多的外泌體。但是幹細胞必須附著於某種物質才能生長，因此一些企業使用懸浮在培養基中的球形微載體來培養幹細胞，這種方法可使外泌體的產量提高20倍。

除此之外，這些公司還要優化從細胞生長培養基中大規模（比研究實驗室要大得多）純化EV的方法。Lötvall認為諸如此類的製造問題是可以克服的，但也會增加用EV遞送藥物的成本。並且，外泌體療法目前還沒有明確的獲批途徑。Cheng說，諸如美國食品藥品監督管理局等藥物監管機構尚未發布有關如何測試這些囊泡的安全性和效力的指引。目前，研究人員和企業逐批對其進行測試，每批測試根據所開發的藥物使用不同的測定方法。

製造人工外泌體可以避開這些挑戰，但是研究人員仍然需要弄清楚外泌體的製備方法，以及為什麼它們可以如此有效地進入細胞並避開免疫系統的監測。只有在回答了這些基本問題之後，這種新的藥物運載方式才能為臨床治療服務。

Amanda B. Keener是科羅拉多州利特爾頓的一位自由職業科學記者。

參考文獻：

1. Alvarez-Erviti, L.et al. Nature Biotechnol.29, 341–345 (2011).

2. Izco, M.et al. Mol. Therapy27, 2111–2122 (2019).

3. Qiao, L.et al. Theranostics10, 3474–3487 (2020).

4. Vandergriff, A.et al. Theranostics8, 1869–1878 (2018).

5. Ingato, D., Edson, J. A., Zakharian, M. & Kwon, Y. J.ACS Nano12, 9568–9577 (2018).

原文以How extracellular vesicles can enhance drug delivery為標題發布在2020年6月18日的《自然》增刊「自然展望 – 細胞外RNA」上。

該增刊亦在《科學美國人》8月刊中登載。

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