磷酸酪氨酸二鈉鹽在CHO流加培養工藝中的應用研究

2021-02-23 Bioprocess

        Fed-batch工藝開發中，補料培養基用於補充細胞培養過程中消耗的營養物質，維持細胞高效的代謝活率和蛋白產物表達。

        上圖中，我們假定不同流加體積的生產工藝產生相同的細胞生長曲線，並且細胞的QP保持一致。如果流加體積佔總培養基體的50%的話，最終抗體表達水平將比流加體積僅佔5%的條件下降低25%左右。所以在流加工藝開發過程中，一個高濃度的補料培養基可以最大限度的降低補料的體積，通過降低補料的體積來增加單位體積內抗體的產量。但是做為補料培養基中的主要成分，胺基酸，在中性條件下的溶解度差異巨大。


       酪氨酸（L-Tyrosine, Tyr）是細胞代謝和蛋白產物表達過程中的一類關鍵胺基酸，但是酪氨酸在中性流加培養基中的溶解度極低，而較高濃度的酪氨酸二鈉鹽濃縮液會出現沉澱析出、培養基不穩定等問題，最終降低細胞流加培養工藝的表達水平。


酪氨酸二鈉鹽的形式可以一定程度提升酪氨酸的溶解度，在基礎培養基中溶解度可提升至1g/L以上，但是更高濃度則很容易形成沉澱析出


如果在超高濃度的補料培養基（胺基酸含量超過100g/L）中，由於不同胺基酸的相互影響，即便是酪氨酸二鈉鹽形式，溶解度也降低至1g/L以下

        為了獲得高濃度的流加培養基，減少流加體積，以獲得更高的細胞密度和蛋白產量。通常需要將流加培養基中的酪氨酸和半胱氨酸（Cysteine, Cys）在鹼性條件下配製成單獨的濃縮液進行流加。但是鹼性補料的流加會對細胞培養體系的穩定性產生影響，並且使流加工藝變得複雜化。



       針對以上問題，本文提出以磷酸酪氨酸二鈉鹽（phosphotyrosine di-sodium salt, PTyr2Na+）作為酪氨酸的來源應用於CHO細胞培養工藝中，並對其應用於fed-batch的工藝表現進行測評，實驗設計思路如下圖所示。


PTyr2Na+的溶解性和穩定性


磷酸酪氨酸二鈉鹽在中性條件下的溶解度相比酪氨酸二鈉鹽形式大幅提升。

PTyr2Na+在Fed-batch工藝的應用

        細胞以2x10^5 cells/mL接種，分別在第3,5,7,9和14天進行流加。對照組流加單獨的Tyr/Cys，實驗組將PTyr2Na+（30mM）加入到主Feed中。兩組實驗不論是在生長和抗體表達水平上均相當。

PTyr2Na+的作用機理


細胞培養液中磷酸酶的活性

細胞裂解釋放出的磷酸酶分解磷酸酪氨酸為自由的酪氨酸


PTyr2Na+對抗體質量的影響


對抗體的糖基化的影響

        磷酸酪氨酸二鈉鹽的高溶解度和穩定性，使其能應用於高濃度（>100g/L）的補料培養基中。雖然其本身不能被細胞直接利用，但是在流加培養過程中，細胞釋放出來的磷酸酶可以持續將PTyr2Na+分解為自由的酪氨酸供細胞代謝使用。在搖管水平和生物反應器中的培養結果顯示，和對照組（流加單獨的Tyr/Cys）相比，在主Feed中加入PTyr2Na+能起到同樣的效果，細胞生長狀態和蛋白產物的表達均可比。並且對最終蛋白的質量（如糖型結構，胺基酸序列等）沒有產生影響。Merck公司最新推出的Cellvento Single Feed即是基於此技術開發的高濃度流加培養基。

參考文獻

Zimmer, A., et al. (2014). J Biotechnol 186: 110-118. PMID:25014403

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