摘要 近年來，用於單抗藥物生產的動物細胞大規模培養技術發展迅速。此領域的技術進展集中在個性化培養基開發，工藝條件優化等方面。本文總結了用於提高重組抗體表達水平的常用方法，以及細胞培養工藝對抗體藥物"關鍵質量屬性"（聚體、降解、糖基化修飾、電荷變異等）的諸多影響。此外，細胞培養工藝在產業化過程面臨著工藝放大與技術轉移，定性研究與工藝驗證等實際問題。未來大規模細胞培養工藝的開發，將進一步藉助動物細胞的組學研究成果和新興的"過程分析技術"。
關鍵詞 重組抗體 大規模細胞培養 培養基優化 工藝開發
引言
目前，多種表達系統均可實現重組抗體的異源表達，但是抗體藥物的產業化製備，始終以動物細胞大規模培養工藝為主[1]。1986年首個治療性抗體OKT3TM上市之初，動物細胞表達水平普遍不足100mg/L。經過近三十年間發展，業內用於重組抗體生產的動物細胞培養工藝，無論細胞培養密度，還是抗體表達水平均提高五十倍以上。流加培養工藝中細胞密度可達1~2×107cell/mL，日均產量200mg/L/day以上（最高可達700mg/L/D），最終收液的容積產率可達3-5g/L（最高達13g/L[2]），培養體積可達20，000L（Lonza, Portsmouth/NH-facility）[3]；灌注培養工藝中細胞密度可達2×108cell/ml，抗體容積產率最高達25~40g/L（Percivia公司XD?灌注系統[4]）。以上行業技術水平的飛速提升，既源於上遊細胞系構建技術的突破[5]，也得益於細胞大規模培養工藝的日臻成熟。尤其是後者綜合培養基開發，工藝優化，結合新型生物反應器的使用，實現了動物細胞的高密度、高表達培養，滿足了臨床上對於抗體藥物"公斤級"產能的需求。
1動物細胞培養的過程參數與培養模式
動物細胞的體外培養，涉及生物反應器的物理參數（溫度、pH、DO、DCO2等）、培養基的營養成分（葡萄糖、穀氨醯胺、胺基酸、維生素等）的消耗，以及自身代謝產物（乳酸、氨、重組蛋白等）的積累與生理生化參數（細胞密度、活性，能荷等）的變化。作為重組抗體生產的"細胞工廠"，上述過程參數的改變會直接影響生產細胞系的活性與重組抗體的收率。比如：當乳酸（58 mM）、滲透壓（382 mOsm/kg）、氨（5.1 mM）參數超過其相應的閾值，細胞活性和抗體產量均會明顯下降[6]。目前，業內已經對於細胞培養過程參數進行了深入的研究，在動物細胞大規模培養中下述參數的控制也已成定式（見表一）。
表1 動物細胞培養的過程參數與控制範圍[7, 8]
Table 1 The parameter and control for animal cell culture process
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| 參數 | 控制（或測定）範圍 | 檢測手段 | 控制策略 |
| 物理參數 | 溫度 | 32~38℃ | 鉑溫度電極 | PI/PID程序控制 |
| pH | 6.8~7.2 | pH電極 | 通CO2或流加鹼液 | |
| DO | 20~60% | DO電極 | 攪拌轉速、通氣量等 | |
| DCO2 | 5~25% （40~180mmHg） | DCO2電極 | ||
| 滲透壓 | 270~330 mOsm/kg | 冰點滲透壓檢測儀 | 流加培養基及流加策略 | |
| 營養物質 | 葡萄糖 | 0~10g/L | 生化分析儀、酶試劑盒 | 葡萄糖限制性流加 |
| 穀氨醯胺 | 0~10mM | 穀氨醯胺限制性流加 | ||
| 胺基酸 | 0~10mM | HPLC | 流加濃縮培養基 | |
| 核苷酸 | 0~10mM | HPLC | ||
| 代謝產物 | 乳酸 | 0~50mM | 生化分析儀、 酶試劑盒 | 使用半乳糖替代葡萄糖 |
| 氨 | 1~10mM | 使用丙酮酸、穀氨酸替代穀氨醯胺 | ||
| 生理參數 | 細胞密度與活性 | 105~108/ml ; >70% | 臺盼藍染色-血球計數板法，活細胞技術儀，生物量電極等 | |
| ATP | 0.5~5pg/cell | HPLC1)、SDS-PAGE2)、 | ||
| 抗體蛋白 | 抗體濃度 | 0.1~10g/L | ELISA3)、protein A HPLC4)、western-blot5)等 | |
| 純度 | 聚體，降解等 | SEC- HPLC6) | ||
| 糖基化水平 | G0、G1F、G2F、Man5等 | HPLC | ||
| 電荷變異 | 酸性變異、鹼性變異 | iCIEF7) 、IEF8)、CEX9)、HPLC | ||
註： 1) High Performance Liquid Chromatography；2) Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis；3) Enzyme-linked Immunosorbent Assay；4) Protein A Affinity Chromatography；5) Protein Immunoblot；6) Size Exclusion Chromatography；7) Imaged Capillary Isoelectric Focusing; 8) Isoelectric Focusing；9) Cation Exchange Chromatography；
1.1 流加培養方式及優化策略
目前上市的重組抗體中絕大多數（如：EnbrelTM、HerceptinTM、RituxanTM、SynagisTM）是採用流加（Fed batch）培養工藝生產，這主要由於與之配套的生物反應器（攪拌罐、氣升罐等）製造成熟，可線形放大（最大至20,000L），操作簡單等原因。但是，流加培養過程中會出現營養物質消耗、代謝廢物積累，以及產品質量不穩定等問題。因此，流加培養工藝的優化主要集中在基礎培養基、流加培養基以及流加策略上[2]2][9] [10] [11]，其優化的原則是根據細胞的代謝特點設計補料培養基，用於補充易耗成分，降低副產物積累[12] [13]。
1.2 灌注培養方式及優化策略
灌注培養模式（Prefusion）下，反應器幾乎可實現"恆化器"培養效果，細胞密度、蛋白產量可較流加模式提高數倍[14] [15]。但是灌注培養細胞截留需特殊裝置，工藝放大存在難度，其產業化應用的經濟性尚存爭議[16] [17]。目前，只有少數抗體（如：ReoProTM、RemicadeTM、SimulectTM、SimponiTM、StelaraTM等）及易降解的重組蛋白（凝血因子）等使用該工藝。灌注培養工藝優化，主要集中在灌注培養基及灌流速度上[18]。 其優化原則是通過降低灌流速度，提高培養基的利用率和產物的容積產率。
此外，控制流加灌注工藝（controlled fed prefusion）同時具有流加工藝和灌注工藝的優點。該工藝對易產生代謝廢物的營養進行限制性流加。根據細胞攝氧量的變化，流加胺基酸以滿足高密度細胞的營養需求。[19]
用於提高重組抗體表達水平的方法
動物細胞的高密度培養，有賴於合適的培養基以及適宜的反應器環境。因此，旨在提高重組抗體表達的工藝開發，主要集中在"個性化培養基"的開發以及過程參數的優化上。上述研究通常需要藉助小型化反應器，如傳統的三角瓶、孔板，轉管（spintube）等。近年，新型自動化小規模反應器（BioLectorTM、SimCellTM、Micro-24TM,ambrTM等）[20]不斷出現，此類裝備不僅能模擬反應器的pH、DO、培養基流加等控制條件，而且能夠實現試驗條件的通量篩選，大大加速了細胞培養工藝開發的進程。如： SimcellTM可同時使用180個微型反應器（650ul）進行工藝條件篩選[21]。Micro-24TM可在孔板規模（5ml）對3L反應器pH，DO，溫度等不同條件進行模擬[22]。
2.1培養基優化方法
早期的動物細胞培養基中常含有胎牛血清或小牛血清。近年工業用培養基的開發趨勢，已經轉向無蛋白 （PF）、無動物源（ADCF），甚至化學成分明晰培養基（CD）[23]。此外，抗體生產企業在培養基開發過程中，還應充分考慮培養基成本（通常<20 ＄/L）、生物安全性與質量穩定性（避免動物源血清、植物源蛋白水解物）以及下遊純化工藝的兼容性等問題[24]。
哺乳動物細胞對營養的需求差別很大，如： NS0細胞的生長依賴於外源性膽固醇，雜交瘤細胞、CHO細胞多為穀氨醯胺營養缺陷型。此外，即使基於同一宿主細胞所構建的的不同克隆，其代謝特點與營養需求也不盡相同。因此，在培養基的開發過程中需特別強調"個性化培養基"的概念，即：生產細胞系所使用的培養基應根據其代謝特點進行優化、定製。下述方法在用於培養優化均有提高重組抗體表達的報導。
2.1.1組分滴定法
組分滴定法（Component titration）是通過設計培養基組分的濃度梯度，來確定其最優濃度。由於動物細胞用培養基成分複雜（常含有70種組分以上），且存在"協同效應"。所以，該方法只適用優化培養中的個別組分（如胰島素、水解物[25]、生長因子等）。
2.1.2培養基混合法
培養基混合法（Media blending）是通過對成分已知的原型培養基進行不同比例混合。藉助DOE（Experiment design expert）軟體進行試驗設計與分析，快速確定最優培養基配方[26]。目前市售培養基優化試劑盒均是據此原理。
2.1.3消耗組分分析法
消耗組分分析法（Spent media analysis），通過對批式培養過程中各組分的消耗情況進行分析，及時補充易消耗組分，調整流加策略。該方法由於檢測手段所限，主要用於葡萄糖、穀氨醯胺、胺基酸等組分的優化[27, 28]。
2.1.4化學計量分析法
化學計量分析法（Stoichiometric Analysis）利用簡化的數學模型，建立葡萄糖、胺基酸，維生素與細胞生物量與重組蛋白合成，以及能量代謝之間化學計量關係。據此進行初始培養基、流加培養基以及流加策略優化，可減少乳酸、氨的生產，該方法在上世紀九十年代提高重組抗體產量至2.4g/L [29, 30] 。
2.1.5理性培養基設計法
理性培養基設計（Rational Culture Media Design），綜合上述三種培養基優化方法。先對大量培養基候選物及混合配方進行篩選，利用最初確定的基礎培養基進行批式培養，分析培養基中易消耗組分，據此設計流加培養基和流加策略。最後，利用組分滴定法確定流加培養基其他添加物（水解物）的最適濃度。最後，優化過的基礎培養基、流加培養基及補料策略，在迷你反應器上進行驗證。這也是大多數CRO公司（Sigma、BD等）開發定製培養基的主要方法[31] [32] [33] [34]。
2.1.5系統培養基開發法
系統培養基開發（Systematic Approaches），是將培養基成分分為胺基酸、維生素、核苷酸等若干組，首先判定對細胞表達影響較為顯著的組別，再針對該組別進行重點的成分優化。[35] [36]
2.2 兩相培養與代謝轉化
絕大多數重組蛋白的生產採用"兩相培養工藝"（biphasic culture process），該工藝中"生長期"與"生產期"採用完全不同的控制策略，如降溫、調節pH，改變流加策略等（見表2）。此工藝中細胞的代謝狀態發生明顯的變化，稱之為"代謝轉化現象"（metabolic shift）即：生長期細胞代謝旺盛，產生大量乳酸，而進入生產期後，細胞生長受到抑制，乳酸產量隨之變小，直至消耗。
2.3 促進異源蛋白表達的小分子物質
某些小分子化合物可以通過改變細胞周期，促進重組蛋白的表達（見表2）。直接在培養基中添加這種物質，是提高目的蛋白產率的簡便方法。此類物質中丁酸鈉（NaBu）和二甲基亞碸（DMSO）應用最多。
表2 細胞培養中用於提高重組抗體表達的方法和物質
Table 2 The summary of methods and compositions used for improving recombinant antibody expression in cell culture process
| 提高表達的策略 | 常用方法 | 作用原理 | 應用 | ||||
| 培養基優化 | 穀氨醯胺、葡萄糖限制流加或使用半乳糖、穀氨酸替代 | 降低乳酸、氨等副產物生產 | [11] [12] [37] | ||||
| 補充易消耗胺基酸 | 豐富培養基營養、添加水解物 | [30, 38] | |||||
| 5磷酸腺苷 （AMP） | ATP前體，能有效抑制細胞生長 | [39] | |||||
| 丙酮酸、蘋果酸、檸檬酸 | 提高三羧酸循環效率 | [40] | |||||
| 補充鐵離子載體（輔酶Q10、亞硒酸、硫酸鐵和檸檬酸鈉） | 增強細胞胞內轉鐵效率 | [41] [42] [43] | |||||
| 補充磷酸鹽，磷酸鹽緩衝液（PBS） | 有助於核酸、細胞膜等的合成 | [44] [45] | |||||
| 補充硫酸銅 | 減少自由巰基，降低抗體聚體含量，減少乳酸生成 | [46, 47] | |||||
| 兩相工藝與代謝轉換 | 降低溫度 | 細胞周期控制在在G0/G1期，提高抗體蛋白轉錄水平等 | [48] [49] | ||||
| 降低pH | 促進細胞代謝轉換 | [38] [50] [51] | |||||
| 提高滲透壓 | 滲透壓脅迫下，細胞的代謝、轉錄、信號傳導等均發生變化。 | [52] [53] | |||||
| 小分子化合物 | 丁酸鈉、戊酸、丙戊酸、丙酸等 | 組蛋白去乙醯化酶競爭性抑制劑，抑制細胞生長。 | [54-57] | ||||
| DMSO | 調節細胞周期至G1期 | [58] | |||||
| 雷帕黴素 | 調節細胞周期至G1期 | [59] | |||||
| 地塞米松 | 增加融合蛋白的唾液酸含量，減少聚體形成 | [60] [61] | |||||
| 氫化可的松 | 降低細胞生長速率，提高細胞活性，和穀氨酸消耗速率 | [62] | |||||
| 芳香羧酸、乙醯胺、異羥肟酸、戊酸 | 提高異源基因轉錄水平 | [63] | |||||
細胞培養工藝對重組抗體質量的影響
作為生物大分子的重組抗體，同時具備聚體、降解、糖基化修飾、氧化、脫醯基化、異構體、二硫鍵錯配等多種變異形式[64]。由"細胞工廠"異源表達的重組抗體，其絕大部分質量變異與生產細胞對重組蛋白的翻譯後修飾作用直接相關，隨著FDA、EMEA對於抗體藥物關鍵質量屬性（Critical quality attributes）的定義與要求，細胞培養對重組抗體質量影響的研究日益深入[65]。（見表二）。
Table 3 The changes of recombinant antibody quality attribute in cell culture process and impact on antibody drug clinical efficacy
表3 細胞培養過程中重組抗體易發生的質量變化以及對臨床效果的影響[65] [66] [67]
| 重組抗體質量變異 | 產生原因 | 臨床效果 |
| 共價聚體 | 二硫鍵的錯配、酪氨酸氧化易形成共價聚體 | 具有免疫原性，靜脈注射發生過敏反應 |
| 非共價聚體 | 抗體分子間的疏水鍵結合形成非共價聚體 | |
| 降解 | 鉸鏈區易發生化學鍵斷裂 | 降低抗體分子的效應功能等。 |
| 生產細胞中含有多種蛋白酶可降解全抗體分子 | ||
| 二硫鍵還原造成H2L、H、L等多種形式降解；抗體分子內部形成三硫鍵等 | ||
| 糖基化變異 | NS0、sp/0細胞能產生NeuGc型唾液酸、Gal-a1,3-Gal等非人源糖基化形式 | 可引起嚴重的免疫反應。 |
| NANA唾液酸修飾半乳糖苷末端 | 提高抗體藥物的抗炎活性 | |
| G0/G1/G2等多種形式的半乳糖修飾 | 改變抗體藥物的CDC效應功能 | |
| 巖藻糖（FUT）修飾、甘露聚糖（Man5）修飾 | 影響抗體藥物的ADCC效應功能 | |
| 電荷變異 | 抗體分子結構修飾會造成攜帶電荷的差異 | 影響抗體在體內的組織停滯和血液清除 |
| 胺基酸變異 | 目的基因變異，轉錄差錯等 | NA |