離子交換層析的應用

2021-01-14 生物純化工藝匠


離子交換層析法是根據電荷特性分離生物分子的一種蛋白純化方法,由於該法操作簡易，解析度高且通量大，迅速成為蛋白質、多肽、核酸及大部分發酵產物分離純化的一種重要方法。本文介紹了離子交換層析的原理，介質以及常見問題解析。

1.離子交換層析的基本原理：

離子交換層析法是蛋白純化的一種方式，通過帶電的生物分子與離子交換層析介質中可交換離子進行交換，從而達到分離純化的目的。


子交換層析法主要依據電荷間的相互作用，利用帶電分子中電荷的微小差異而進行分離，具有較高的分離容量。幾乎所有的生物大分子都是極性的，都可使其帶電，所以離子交換層析法的應用很廣泛。

2.離子交換層析的介質：

有許多離子交換介質都已經商品化，但不存在一種神奇的介質其最適合各種蛋白質的純化。選擇離子交換介質的標準包括應用的特異性需要、樣品成分的等電點和分子大小（即目的蛋白和汙染物），以及可得到的裝備（如層析系統和層析柱）。

千純生物可以提供提供FF、HP、XL、HF基質的離子交換填料（陰離子交換和陽離子交換），適用於樣品的初級分離純化、精細分離純化、超高載量要求等；全新基質Rigose系列的離子交換填料具有高載量、高解析度、高耐壓（0.5Mpa）、高流速的特點，廣泛應用於重組蛋白、疫苗的純化。

首先需要選擇陰離子或陽離子介質，如果目的蛋白的等電點已知，選擇陰離子介質且操作的pH高於目的蛋白的pI，或選擇陽離子介質且操作pH低於目的蛋白的pI。如果靶蛋白的pI未知，開始之前最好先測定它。最佳操作pH可根據經驗確定。因為大多數蛋白質的pI低於7，選擇陰離子交換和操作pH為8.5開始是合理的，然後根據估計結果和優化條件。知道蛋白質溶液中汙染物pI和結合特徵也是有用的。

3.離子交換層析的緩衝系統：

必須根據需要的pH範圍選擇緩衝系統，必須考慮的因素包括所用的離子交換類型、樣品的pH穩定性和使用的pH範圍，以及需要的緩衝能力，最後是成本。下表列出了各種有用的緩衝液。緩衝液中的添加成分（如變性劑和蛋白酶抑制劑）也應和離子交換介質帶有相同的電荷，以組織結合。

pK（25℃）pH範圍緩衝液工作濃度/(mmol/L）溫度因子陰離子交換4.754.5~5.0N-Methylpiperazine20-0.0155.685.0~6.0Piperazine20-0.0155.965.5~6.0L-Histidine20
6.465.8~6.4Bis-Tris20-0.0176.806.4~7.3Bis-Tris propane20
7.767.3~7.7Triethanolamine20-0.028.067.6~8.5Tris•Cl20-0.0288.528.0~8.5N-Methyladiethanolamine50-0.0288.888.4~8.8Diethanolamine20(pH8.4）-0.0258.648.5~9.01，3-Diaminopropane20-0.031


pK（25℃）pH範圍緩衝液工作濃度/(mmol/L）溫度因子陽離子交換2.001.5~2.5Maleic acid20
2.882.4~3.4Malonic acid20
3.132.6~3.6Citric acid20-0.00243.813.6~4.3Lactic acid50
3.753.8~4.3Formic acid50+0.00024.214.3~4.8Butanedioic acid50-0.00184.764.8~5.2Acetic acid50+0.00025.685.0~6.0Malonic acid50
7.206.7~7.6Phosphate50-0.00287.557.6~8.2HEPES50-0.0140


4.離子交換層析常見問題解析：

問題可能的原因解決方案在鹽梯度中蛋白質不能洗脫緩衝液的pH不對
鹽濃度太低使用pH更靠近蛋白質pI的緩衝液
使用更濃的洗脫緩衝液蛋白質出現在清洗相中結合緩衝液的鹽濃度太高
樣品的鹽濃度太高或pH錯誤
柱子沒平衡好
離子變性劑或其他添加劑
結合到柱子上降低結合緩衝液的鹽濃度
更換樣品的緩衝液
重複或延長平衡時間直到電導恆定
清洗柱子解析度比預想的要低梯度斜率太抖
流速太高
蛋白質或脂質沉澱到柱子上
樣品上樣前沒有恰當過濾
蛋白形成聚合體
凝膠緊密結合
柱子安裝不好
檢測儀的流動池或柱中或柱後的混合體積太大使用更平緩的梯度或增加一個平臺
較低的流速下分離
清洗和再生柱子
再生柱子、過濾樣品、重複層析
使用脲素或變性劑清洗柱子
運行有色的化合物觀察條帶檢測裝柱效果，如有必要重裝柱子
更換流動池或減小柱後體積層析圖中峰形前拖尾或太圓柱子超載
柱子沒裝好
柱子需要再生降低樣品的上樣量，重複試驗
運行有色的化合物觀察條帶檢測裝柱效果，如有必要重裝柱子
清洗再生柱子，如果這樣還不行，換一個新的層析圖匯總峰形拖尾樣品太黏
柱子的濾器上或凝膠床的頂部
發生了蛋白沉澱
柱子裝的不好減低蛋白質的量，從樣品中出去核酸
清洗柱子，更換或清洗濾器獲得的蛋白質量正常但活性低靶蛋白在洗脫緩衝液中不穩定，因而失活了
酶與輔酶或對其活性是必需的因子分離
柱子上有微生物生長變換洗脫條件
收集所有的組分進行測定並重複試驗
清洗柱子並且在20%乙醇中或其他抑菌劑中保存凝膠洗脫級分中蛋白質的量比預想的少得多蛋白質被蛋白酶降解
在樣品的準備中蛋白質吸附到過濾器上
柱子上有微生物生長在緩衝液中加蛋白酶抑制劑
使用其他型號的濾器並在緩衝液中加變性劑
清洗柱子並且在20%乙醇中或其他抑菌劑中保存凝膠

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