2020年03月20日，鄭敏君向國家知識產權局提出了無效宣告請求，其理由是全部權利要求不符合專利法第25條第1款、第26條第4款、第22條第3款的規定，說明書不符合專利法第26條第3款的規定，請求宣告本專利權利要求全部無效。
請求人認為：
（1）本專利權利要求1所要求保護的啟動子並非首次從自然界分離或提取出來的DNA片段（參見證據1、證據2），而且本專利的實施例並沒有證明SEQ7具有啟動子活性，因此屬於不能被授予專利權的科學發現，不符合專利法第25條第1款的規定。
（2）本專利說明書公開不充分，不符合專利法第26條第3款的規定。sodA在好氧菌細菌線粒體中普遍存在，實施例1未設置任何對比試驗，並未驗證SEQ7的下遊蛋白CJ7過表達，僅能說明CJ7表達豐度相對其他蛋白較高。實施例2沒有給出定性實驗數據，亦沒有設置對照實驗，不能驗證SEQ7具有啟動子活性。實施例4表4明確證明了在大腸桿菌中SEQ7啟動子比tac啟動子活性差，實施例3的百分比數值缺乏可比性，沒有設置空白對照組，沒有排除背景底噪或劣性對比的情形，不能證明SEQ7啟動子比tac啟動子有更強的啟動活性。實施例5並沒有驗證SEQ7啟動子是否為組成型或誘導型啟動子，SEQ7啟動子不僅沒有產生有益的效果，對於產業也沒有顯著進步。SEQ7啟動子與SEQ1啟動子完全不同，在專利授權或無效程序中應對兩者獨立進行審查，對於SEQ7的技術效果及審查標準不能直接套用SEQ1的相關內容。
（3）本專利權利要求1不清楚，不符合專利法第26條第4款的規定。權利要求1的保護範圍至少包括了兩種可能：第一種「鹼基序列是由SEQ ID NO：7表示的多核苷酸組成」；第二種「鹼基序列是由SEQ ID NO：7表示的多核苷酸中第1-317位多核苷酸組成」，因此權利要求1實質上是在同一個權利要求中限定出了不同的保護範圍。此外，本專利權利要求1表述為「啟動子，其鹼基序列是由SEQ ID NO：7表示的多核苷酸」不是個完整的句子。以上兩點致使該權利要求的保護範圍不清楚，不符合專利法第26條第4款的規定。
（4）本專利權利要求5、6得不到說明書的支持，不符合專利法第26條第4款的規定。參見證據8、證據9，各菌種啟動子序列差異較大，本專利表3-4也表明了同種菌不同啟動子的表達差異，以及相同啟動子在不同宿主菌種的表達差異。因此，權利要求5中棒桿菌屬概況了一個較寬的保護範圍，得不到說明書的支持。基於相同的理由，權利要求6亦概括了一個較寬的保護範圍，得不到說明書的支持。
（5）本專利權利要求1-3、5、6不具備創造性，不符合專利法第22條第3款的規定。證據10和證據11教導了在正常的培養條件下大腸桿菌sodA啟動子是強啟動子。權利要求1與證據10或11的區別在於兩者啟動子不一樣。在證據3、12、13、14的教導下，本領域技術人員有足夠的動機從棒桿菌中尋找內源性sodA強啟動子。證據9克隆了棲糖蜜棒桿菌錳超氧化物歧化酶sodA基因的完整結構，具體公開了其啟動子及其結構接近穀氨酸棒桿菌的啟動子結構，證據7教導了從產氨棒桿菌中探索尋找高活性內源性組成型啟動子CAT的報導，證據9、證據15教導了穀氨酸棒桿菌的sodA區域與Fe/MnSOO家族其他成員的序列具有很強的同源性，而穀氨酸棒桿菌及白喉棒桿菌的全基因組序列均是現有技術己知的技術內容。因此對本領域技術人員而言，通過近種棒桿菌的sodA區域的保守區設計引物擴增獲得產氨棒桿菌的sodA基因啟動子序列對本領域技術人員而言是顯而易見的，並不存在技術障礙。此外，本專利涉及SEQ7的啟動子並沒有證明其具有啟動活性，更沒有證明其比tac啟動子效果好。因此，權利要求1不具備創造性，不符合專利法第22條第3款的規定。
專利權人認為：
（1）請求人給出的證據並未記載權利要求1所保護的啟動子；本專利說明書已經證明了所保護的啟動子序列的活性，例如實施例公開的實驗數據。因此，本專利不屬於專利法第25條第1款規定的不能授予專利權的科學發現。
（2）實施例1示例性給出了選擇和發現啟動子的方法和過程而不是證明過氧化錳歧化酶的高表達，而且實施例2-4的實驗數據也驗證了該啟動子的活性。因此，有關過表達的無效理由沒有事實和科學依據，關於「SodA的表達豐度較其他蛋白更高屬於正常現象」未舉證。實施例2的第0064、0065段給出的是定性實驗，第0066、0069段給出的是定量實驗，其使用的Bradford法測定蛋白總量常用於實驗中，沒有必要純化或鑑定蛋白，也沒有證據表明細菌生長周期或者存在底噪蛋白會對GFP的檢測造成影響。tac啟動子是本領域公知且公認的較強的啟動子，因此實施例3將本申請的pcjl-7與tac的啟動子活性進行比較，以說明其有益技術效果。實施例4中pcj7的啟動子活性在大腸桿菌中不如tac並不能否認pcj7的有益技術效果。並沒有證據表明空白值、背景值或底噪值影響了實驗數據。儘管實施例5不涉及pcj7啟動子，但實施例1-4已經完全滿足了pcj7啟動子的充分公開的要求。關於SEQ7啟動子與SEQ1啟動子完全不同的觀點，沒有事實依據，也與專利法第26條第3款的規定無關。
（3）請求人所述的兩個保護範圍，可以理解為在一個保護範圍下的兩種情況或者是兩個實例，並不會導致權利要求的不清楚；權利要求1有關啟動子的描述是本領域常用的一種表述方式，請求人指出的權利要求1描述句子不完整的缺陷並不存在。
（4）在本專利已經證明權利要求1所述啟動子在棒桿菌中具備了調節非內源性通用報告基因表達的啟動子活性，而且在大腸桿菌中也具備一定的啟動子活性的情況下，本領域技術人員能夠判斷，該啟動子在其它的棒桿菌中也具備啟動子活性。在沒有相反證據的情況下，權利要求5以及引用權利要求5的權利要求6得到了說明書的支持，符合專利法第26條第4款的規定。
（5）首先，產氨棒桿菌過氧化錳歧化酶基因是現有技術中未知的基因，無法從現有技術中得到任何啟示來尋找鑑定該基因的啟動子，請求人引用的證據3、證據7以及證據9-15均未涉及產氨棒桿菌及其基因序列相關信息，本領域技術人員無法獲知產氨棒桿菌中各種基因序列及其表達情況，也就無法從現有技術中得到任何有關產氨棒桿菌過氧化錳歧化酶基因的任何技術啟示，更無法確定其啟動子的活性。其次，權利要求1保護的啟動子是專利權人通過創新性方法發現和鑑定的，利用二維電泳技術首先鑑定出高表達蛋白質，對其胺基酸序列進行測序來反推該蛋白的基因序列，再通過基因序列來鑑定該基因的啟動子序列。最後，通過啟動子調節報告基因的表達，驗證了啟動子的活性。再者，即便將請求人使用的全部九篇證據結合在一起，也得不到權利要求1保護的技術方案，這足以證明權利要求1所包含的啟動子的創造性。因此，權利要求1具備創造性。
國家知識產權局本案合議組於2020年08月11日舉行了口頭審理。
合議組認為：
（1）科學發現，是指對自然界中客觀存在的物質、現象、變化過程及其特性和規律的揭示，其不同於改造客觀世界的技術方案，不是專利法意義上的發明創造，因此不能被授予專利權。但是，根據科學發現進一步通過技術手段的引入來製備得到相應的產品並將其用於具體的用途不再屬於科學發現。
證據1公開日在本專利申請日之後，且未公開SEQ7的具體啟動子序列；證據2僅對穀氨酸棒狀桿菌野生菌株ATCC13032的完整基因組序列進行了分析，但並未具體揭示SEQ7的序列為啟動子，因此證據1和證據2均不能表明本專利的啟動子在申請日之前已被從自然界分離或提取出來，而且，如上所述，本專利說明書已對SEQ7的啟動子功能進行了清楚、完整的說明。另外，本專利權利要求保護的是基於SEQ7的功能而製備的產品或利用其功能的方法，其是在科學發現的基礎上通過技術手段的引入進一步形成的發明創造，不屬於科學發現的範疇。因此，請求人關於權利要求1-3、5-6不符合專利法第25條第1款規定的理由不能成立。
（2）實施例1記載了利用二維電泳技術鑑定出高表達蛋白質，對其胺基酸序列進行測序來反推該蛋白的基因序列，再通過基因序列來鑑定該基因的啟動子序列。即，實施例1示例性給出了選擇和發現啟動子的方法和過程而不是證明過氧化錳歧化酶的高表達，所發現的啟動子的效果驗證過程記載在實施例2-4中。因此，實施例1中是否證明CJ7過表達並不影響本專利請求保護的啟動子的獲得以及效果證明。另外，請求人對「sodA的表達豐度較其他蛋白更高屬於正常現象」的主張未舉證，即使該現象確實存在，也不影響本專利通過實施例1的方法發現了SEQ7的啟動子及其效果。
實施例2通過將擴增獲得的pcj7啟動子與綠色螢光蛋白（GFP）基因插入表達載體、轉化產氨棒桿菌、並測定細菌提取物中GFP的螢光強度驗證了pcj7啟動子在產氨棒桿菌中具有高活性，能夠指導GFP基因高效表達，其中表2給出了具體的螢光強度值，即定量數據。由於綠色螢光蛋白為外源導入的蛋白，通常在細菌中不含有其它綠色螢光蛋白，因此只需要測定總蛋白中的綠色螢光強度即可反映啟動子的活性大小，而沒有必要純化或鑑定蛋白；並沒有證據表明細菌生長周期或者存在底噪蛋白有可能對GFP的檢測造成影響，而且pcj1-pcj7為平行實驗，相互之間也可以作為對照，即使存在上述影響，平行實驗的數值相互對照也可以在一定程度上消除所述影響。
雖然tac啟動子在大腸桿菌和棒狀桿菌中的活性存在差異，但實施例3以常用於產氨棒狀桿菌中的tac啟動子作為參照，有利於尋找到在棒狀桿菌中的高活性啟動子。實施例3比較了pcj1-pcj7的啟動子活性，並沒有證據表明空白值、背景值或底噪值影響了實驗數據，即使有的話，由於pcj1-pcj7以及tac啟動子的實驗是平行實驗，可以將tac作為對照，排除所述影響，而且表2和表3中各啟動子的強弱順序是一致的，也可以作為佐證。另外，實施例4中pcj7的啟動子活性在大腸桿菌中不如ptac啟動子的事實並不能否認pcj7在棒狀桿菌中的有益技術效果。
實施例5對pcj1和ptac在產氨棒狀菌和大腸桿菌中IPTG的影響進行了對比，其實際是對pcj1性質的研究。由於證據1、3-7均未公開pcj7啟動子，請求人對於pcj7啟動子屬於誘導型啟動子的猜測並無確切依據。雖然該實施例5不涉及pcj7啟動子，但如上所述，實施例1-4已經證明了pcj7啟動子的活性，即無論SEQ7啟動子是組成型還是誘導型啟動子，實施例1-4都已經證明其取得了有益的效果。
如前所述，說明書對於SEQ7啟動子功能驗證已足以說明其具有比常用的tac啟動子具有更強的活性，SEQ1啟動子記載了更多的實驗數據並不影響說明書對於SEQ7啟動子已作出了清楚、完整的說明。
綜上所述，請求人關於本專利說明書不符合專利法第26條第3款規定的理由不能成立。
（3）本案權利要求1保護一種啟動子，其鹼基序列是由SEQ ID NO：7表示的多核苷酸。說明書已經指出了從表1中的蛋白質推定基因序列並分析以選擇啟動子區，推定了CJ7的蛋白質的基因序列分離的SEQ ID NO：7的寡核苷酸具有啟動子活性。雖然說明書驗證的是比SEQ ID NO：7少一位核苷酸的啟動子的功能，但權利要求可在說明書具體實施方式的基礎上進行概括，權利要求1已明確限定了保護的啟動子的序列是由SEQ ID NO：7表示的多核苷酸，應當理解為SEQ ID NO：7所表示的全部318位多核苷酸組成的核苷酸序列，並非由SEQ ID NO：7表示的多核苷酸中第1-317位多核苷酸組成的核苷酸序列，該保護範圍是確定的。另外，權利要求1中的「啟動子」是要求保護的主題，「其鹼基序列是由SEQ ID NO：7表示的多核苷酸」為啟動子的特徵限定，並不存在請求人所述描述句子不完整的缺陷存在。因此，請求人關於權利要求1不清楚，不符合專利法實施細則第20條第1款規定的理由不能成立。
（4）證據8、證據9僅表明在棒狀桿菌的不同菌株中存在與SEQ7序列不同的啟動子，但並不能表明SEQ7的啟動子序列在引入棒狀桿菌的不同菌株中後，其活性有很大差異。至於本專利表3-4中表明的不同菌中啟動子的差異是在棒狀桿菌和大腸桿菌中的差異，權利要求5已具體限定到了棒狀桿菌，排除了棒狀桿菌以外的其它宿主。本專利實施例驗證了當使用屬於棒桿菌屬的產氨棒桿菌CJHB100作為宿主細胞時，本發明的啟動子能夠高效啟動載體中報告基因GFP的表達。基於本專利說明書背景技術部分的記載，棒桿菌屬細菌是用於生產多種化學物質的微生物，所述化學物質如動物飼料、藥品和食品，包括L-賴氨酸、L-蘇氨酸和多種核酸。可見，棒桿菌屬細菌是本領域廣泛應用的一類傳統工業微生物，本領域技術人員熟悉棒桿菌屬細菌的種類、特性，在說明書已經證明本專利的啟動子在產氨棒桿菌中具有高效調節基因表達的活性，且無相反證據表明不同的棒桿菌屬菌株會導致啟動子活性出現較大差異的情況下，本領域技術人員能夠容易地根據工業生產的實際需要及其公知常識，通過有限的常規實驗在棒桿菌屬的菌株類別中選擇出合適宿主菌株，並能夠預期本發明的啟動子在所述細胞中具有良好的啟動子活性。因此，權利要求5得到了說明書的支持，請求人關於權利要求5不符合專利法第26條第4款規定的理由不能成立。
（5）請求人在評述權利要求1的創造性時，並未採用「三步法」的評述方法。雖然請求人在將權利要求1與證據10或證據11教導的大腸桿菌sodA啟動子進行對比後，確定其區別在於兩者啟動子不一樣，但並未結合其它證據表明何種現有技術提供了SEQ7可作為啟動子的技術啟示，而是以多篇現有技術結合能夠提供研究思路去獲得來自產氨棒狀桿菌的sodA啟動子序列，進而可以獲得SEQ7所示序列作為評述理由。但是，證據10研究的是DNA旋轉酶抑制劑對大腸桿菌中sodA轉錄調控的作用，證據11公開了百草枯對AcnA和sodA的調控作用，即二者目的均在於研究sodA的調控機理，而不是要尋找更高活性的啟動子。證據3提出雖然棒狀桿菌和枯草桿菌之間的啟動子一致序列非常相似，但在它們之間很可能存在著一定的轉錄和轉譯障礙；證據7雖然分離了若干來自產氨棒狀桿菌的轉錄起始信號，並比較其在產氨棒狀桿菌和大腸桿菌中的基因表達水平，找到了幾個強啟動子，包括本專利作為對照的tac啟動子，但並未發現sodA啟動子為強啟動子；證據9從棲糖蜜棒桿菌克隆了sodA基因及超氧化物歧化酶對細胞活力的作用，但其僅對啟動子的各結構域進行了分析和預測，並沒有對啟動子的活性進行試驗，而且該啟動子與本專利從產氨棒桿菌中分離的sodA啟動子序列也不相同，本領域技術人員難以預期序列為SEQ7的啟動子為強啟動子；證據12、13對穀氨酸棒桿菌的啟動子進行了研究，證據14提出大腸桿菌啟動子在棒狀桿菌啟動子中啟動效率明顯降低，證據15對白喉棒桿菌NCTC13129完整基因組序列進行了分析，但均未提出sodA啟動子為強啟動子。本領域技術人員就無法從現有技術中得到任何有關產氨棒桿菌過氧化錳歧化酶基因的啟動子為高活性啟動子的任何技術啟示。本專利已驗證了SEQ7的啟動子比常用的tac啟動子具有更強的活性。因此，權利要求1相對於請求人所述的證據3、證據7以及證據9-15的組合具備突出的實質性特點和顯著的進步，請求人關於權利要求1不具備專利法第22條第3款規定的創造性的理由不能成立。
綜上，請求人提出的全部無效理由均不能成立，本案合議組根據上述事實和理由作出維持該發明專利權部分有效的決定。