基因組編輯工具鋅指核酸酶(ZFN)研究進展——2011生物谷研究盤點

鋅指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)，又名鋅指蛋白核酸酶，不是自然存在的，而是一種人工改造的核酸內切酶(圖1)，由一個 DNA 識別域和一個非特異性核酸內切酶構成，其中DNA識別域賦予特異性，在DNA特定位點結合，而非特異性核酸內切酶賦剪切功能，兩者結合就可在DNA特定位點進行定點斷裂。

圖1. 結合到DNA(橙色)上的鋅指核酸酶(藍色)，圖片來自維基共享資源，Thomas Splettstoesser

DNA識別域是由一系列 Cys2-His2鋅指蛋白串聯組成，研究還表明每個鋅指蛋白識別並結合3′到5′方向DNA鏈上一個特異的三聯體鹼基以及5′到3′方向的一個鹼基。

鋅指蛋白源自轉錄調控因子家族(圖2)，在真核生物中從酵母到人類廣泛存在，其共有序列為(F/Y)-X-C-X2−5-C-X3-(F/Y)-X5-ψ-X2-H-X3−5-H，其中X為任意胺基酸，ψ是疏水性殘基。它能形成α-β-β二級結構，每個鋅指蛋白含有單個鋅離子，這個鋅離子位於雙鏈反平行的β摺疊和α螺旋之間，並且與β摺疊一端中的兩個半胱氨酸殘基和α螺旋螺旋羧基端部分的兩個組氨酸殘基形成四配位化合物，此外α螺旋的16胺基酸殘基決定鋅指的DNA結合特異性，骨架結構保守。

圖2. Cys2-His2鋅指單元首先是在TFIIIA中鑑定出的。TFIIIA含有9個大約30個胺基酸基序的串聯重複。

現已公布的從自然界篩選的和人工突變的具有高特異性的鋅指蛋白可以識別所有的GNN和ANN以及部分CNN和TNN三聯體。多個鋅指蛋白可以串聯起來形成一個鋅指蛋白組識別一段特異的鹼基序列，具有很強的特異性和可塑性，很適合用於設計ZFNs。

與鋅指蛋白組相連的非特異性核酸內切酶來自FokI羧基端96個胺基酸殘基組成的DNA剪切域。FokI是來自海床黃桿菌的一種限制性內切酶，只在二聚體狀態時才有酶切活性，每個FokI單體與一個鋅指蛋白組相連構成一個ZFN，識別特定的位點，當兩個識別位點相距恰當的距離時(6~8 bp)，兩個單體ZFN相互作用產生酶切功能。從而達到 DNA 定點剪切的目的。

一、ZFN工作原理
針對靶序列設計8~10個鋅指結構域，將這些鋅結構域連在DNA核酸酶上，便可實現靶序列的雙鏈斷裂(Double strand break, DSB)。Kim等使用該策略設計出了第一個鋅指蛋白核酸酶，該酶使用3個鋅指結構域連接一個FokI核酸酶的催化活性功能域。結果表明人工合成的 ZFN 可以特異性的識別切割靶位點。ZFN 要切割靶位點必須以二聚體綁到靶位點上。因此兩個ZFN分別用鋅指結構識別5′到3′方向和3′到5′方向的DNA鏈，兩個FokI核酸酶的催化活性功能域可以切割靶位點。

當兩個ZFN分別結合到位於DNA的兩條鏈上間隔5至7個鹼基的靶序列後，可形成二聚體，進而激活FokI核酸內切酶的剪切結構域，使DNA在特定位點產生雙鏈斷裂(圖3)，再通過非同源末端連接或同源重組修復斷裂(圖4)。

圖3. ZFN作用示意圖，不同的FokI核酸內切酶結構域與識別特定序列的鋅指模塊結合形成ZFN。右側ZFN與左側ZFN分別結合9-18bp長度的靶序列，並形成二聚體，FokI核酸內切酶的剪切結構域對兩端靶序列中間的DNA序列進行剪切。

當兩個ZFN切割靶位點，製造出雙鏈斷裂以後，細胞的修復機制被激活，DNA的同源重組機制會將同源片段複製到斷裂缺口上，從而達到引入基因片段的目的。ZFN製造出雙鏈斷裂，DNA同源重組修復引入外源片段的效率增加了幾千倍(圖4)。此外也有通過非同源末端連接(Non-homologous end-joining, NHEJ)引入外源基因片段的報導，該方法所需的外源基因片段可以縮短到50bp左右。

圖4. ZFN介導的靶向基因修飾的細胞DNA損傷修復途徑

如果DNA修復是非同源的末端連接，將會有大約70%的概率通過隨機刪減或添加可以引起移碼突變的鹼基，或無義突變引起蛋白質長度變化，從而導致基因敲除，如果修復過程中引入模板發生同源重組可以對目標基因進行修飾。

非同源重組末端連接機制在體細胞的 DNA 損傷修復中起主導作用，而同源重組機制傾向於在 ES細胞中正調節。在早期胚胎中，由核酸內切酶引起的雙鏈斷裂會選擇兩種機制的哪一種，以及這兩種機制如何被調節，也會是未來 ZFN 研究中的重點。

二、ZFN設計
因為ZFN識別和結合特異性是由一系列 Cys2-His2鋅指蛋白串聯組成的DNA識別域決定的，所以在設計ZFN時主要還是設計如何將多個Cys2-His2鋅指蛋白串聯，以及如何通過改變α螺旋的16胺基酸殘基決定每個鋅指蛋白識別和結合特定的三聯體鹼基。

Isalan等使用噬菌體展示技術鑑定了與靶DNA序列具有較高親和力的鋅指結構，該實驗表明根據已知的DNA序列可以找到與之結合的鋅指結構。由於一個鋅指結構域只能識別3 bp (Base pair)。對於全基因組來說至少有18bp才能確保靶位點的特異性。因此需要有8~10個鋅指結構連在一起才能實現長片段的識別。因為Doyon等用8個鋅指結構域實現了DNA的特異識別，而且沒有脫靶現象，因此可以認為 8~10 個鋅指結構域就可以實現靶位點的特異識別。

但是隨著DNA加長，9 bp並不對應3個鋅指結構域，因此 Moore等的實驗設計了兩種策略來確定鋅指結構域: (1) 3×2F，這種方法在靶序列中，每隔6個鹼基跳過一個鹼基，兩對鋅指結構域之間插入一個甘氨酸(GLY)。(2) 2×3F，這種方法在靶序列中，每隔9個鹼基跳過兩個鹼基，兩個三聯體鋅指結構域之間插入甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸(Gly-Ser-Gly)。實驗表明2×3F方法設計的鋅指蛋白對靶位點的突變非常敏感，因此2×3F方法設計的鋅指蛋白對靶序列的識別特異性更高。

人工合成的鋅指結構域採用了通用的胺基酸序列作為模板，這個胺基酸序列框架被證明是高效的，如圖4所示。鋅指結構域中有7個胺基酸殘基(XXXXXXX)用於識別三聯體鹼基，X位置為可變的胺基酸，改變這些胺基酸可以識別不同的三聯體鹼基，其上部表示胺基酸在α螺旋上的位置。因此可以通過改變這些胺基酸殘基來提高鋅指結構域識別靶DNA的特異性。TGEK序列用於連接相鄰的兩個鋅指結構域。

圖5 鋅指結構通用胺基酸序列

目前的實驗已經測定了一些識別三聯體鹼基的鋅指結構域胺基酸序列(Maeder ML et al.; Wright DA et al.)，這些胺基酸序列被證實與靶序列有較高的親和力。在設計鋅指蛋白的時候通常以這些胺基酸序列作為參考。

雖然是以設計ZFN的DNA結合域為主，但是也可對目前使用的ZFN的核酸酶結構域進行突變改造了，這樣可以防止同源的ZFN結合在一起，造成非特異性切割。

最後，因為Sangamo公司是鋅指核酸酶的專利持有者，所以該技術一直以來被Sangamo生物公司所壟斷，該公司只與部分科研機構合作。現在這種形勢得到了改變，一個由八個實驗室組成的協會，波士頓麻省總醫院分子生物學家J. Keith Joung召集八個實驗室組成協會提出了一個開放性代碼方法應用製備有效的鋅指核酸酶。該組織創建了一個資料庫，裡面有66個「鋅指」庫，每一個鋅指結構可與一個特異的DNA位點結合。這些特異的鋅指結構與Fok I核酸酶結合，可特異地剪接一種植物細胞基因和3種人類細胞基因，剪接後達到預先改造基因的效率高達50%，而傳統的基因療法改造基因的效率只有1%。

該鋅指技術協會將66種鋅指結構蛋白儲存在在低溫冰箱裡，每一個實驗室都可以通過以200美元的價格預定一種鋅指蛋白。該協會計劃擴增鋅指結構的儲存量，製備192種鋅指結構，而這麼多種鋅指結構通過組合就足以滿足與人類基因組任一位點結合的目標。Joung說，這一計劃為每一位學術研究者提供了便利，這樣他們無需通過Sangamo公司就能直接獲得鋅指。雖然現在科學家們可通過申請獲得鋅指結構，但是設計與鋅指結構結合的核酸酶不是件簡單的事，一個分子生物學的研究生或是博士生要想設計完美的鋅指核酸酶至少要花費1到2個月的時間。

鋅指技術協會面向所有研究者提供免費的OPEN(Oligomerized Pool Engineering）設計，OPEN 設計及其資料是共享並可免費獲取的(http://www.addgene.org/zfc; www.zincfingers.org/software-tools.htm)。

基於此，後來人們又提出ZFN 識別結構域的兩種主要設計思路：其一是簡單地將能夠識別三個連續鹼基的鋅指作為一個「模塊」，再根據目標序列把不同的 「模塊」拼接在一起，這種方法被稱為 「模塊組裝法」。這種設計思路中ZFN特異性的效率是由每一個模塊的特異性效率所決定的，模塊活性的篩選方法主要是利用細菌雙雜交 (B2H) 技術：將目標序列克隆到報告基因的上遊調控區，一個「模塊」與誘餌蛋白組裝成融合蛋白，靶蛋白與 RNA 聚合酶組裝成融合蛋白，通過定量檢測報告基因產物來比較模塊識別結構域與目標序列的親和性，再將多個高親和性模塊組裝，再次測試親和性。這種方法的缺點在於即使每一個模塊的親和性都很高，組裝所產生的綜合作用卻不一定理想，可能的原因在於多個鋅指蛋白之間的空間結構及作用力相互產生不可預期的影響。

另一種設計思路是上文所提到的OPEN，同樣利用了細菌雙雜交技術進行篩選，OPEN 作為一個共享的鋅指資源庫，每個鋅指庫中針對一個特異的三聯鹼基包含了大量的不同胺基酸序列的鋅指識別結構域，通過將不同的庫組合在一起可以得到成百上千種 ZFN的組合，其中親和性高的組合將激活下遊的藥物篩選基因，並在選擇培養基中獲得競爭優勢。

三、ZFN應用
在談及ZFN應用之前，先以小鼠和大鼠基因敲除的發展歷史來談談先後採用哪些技術來實現的以及它們各自的不足。

基因敲除模式動物非常適合用於研究基因功能。在哺乳動物中，特異性基因組序列打靶傳統上只在小鼠身上開展。該技術需要通過同源重組在多功能胚胎幹細胞上進行基因/外顯子打靶。成功實現基因打靶的胚胎幹細胞克隆細胞系注射進胚泡產生嵌合小鼠，再通過異型雜交獲得更為強健的小鼠培育系以便實現重組工程轉基因的生殖系傳遞(germline transmission)。這種方法耗時，只是用於極少數特定的小鼠近交系。但是通過同源重組在多功能胚胎幹細胞中產生基因敲除大鼠還沒獲得成功，最大的障礙在於不能建立生殖系有活性的多功能胚胎幹細胞。然而，在多個實驗室的努力下，研究人員已經能夠採取一種複雜的實驗方法獲得生殖系有活性的多功能胚胎幹細胞並且同時維持這些胚胎幹細胞的多能性。

隨著大鼠越來越成為基因研究模式生物，人們也採用其他的生殖系打靶技術，如精原幹細胞(spermatogonial stem cell)慢病毒轉基因技術、體細胞核移植(somatic cell nuclear transfer)，但是都沒有取得成功。但是其他的基因組操縱策略如RNA幹涉介導的基因沉默和兩種靶標選擇性基因敲除技術，即N-乙基-N-亞硝基脲誘變(ENU mutagenesis)和轉座子介導的基因捕獲。N-乙基-N-亞硝基脲誘變產生隨機性點突變，它的優勢在於能夠潛在性用於鑑定一個基因的多個等位基因，但是也只在基因編碼區提前產生終止子才能確保等位基因被敲除。而轉座子介導的基因捕獲通常利用諸如睡美人轉座系統(Sleeping Beauty transposon system)之類的轉座子實現插入性突變，但是突變率比較低，它的優勢在於只當轉座子從捕獲基因上跳出時產生的等位基因遭到破壞，從而實現基因敲除。

利用ZFN在基因組特定位點---如靶基因上一個外顯子---產生DNA雙鏈斷裂。每個ZFN上的FokI結構域產生平端的雙鏈斷裂。但是由於FokI結構域切割不是非常精確，它將會在不同位點進行DNA切割，產生大同大小的缺失片段。細胞內雙鏈斷裂修復系統中錯誤傾向的非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)封閉這種缺口。如果針對的是靶基因外顯子的話，這種過程經常導致無義突變，從而產生等位基因敲除。該技術的優勢在於它能應用於多種多樣的細胞類型，包括單細胞期胚胎，這就使得它在缺乏多功能幹細胞的模式生物如果蠅和斑馬魚中也大有作為。

但是ZFN誘導的雙鏈斷裂並不一定會導致靶基因被適當替換，這可能是因為NHEJ更加頻繁地發生。但是在NHEJ存在缺陷的遺傳背景，如即缺乏NHEJ必需的基因DNA連接酶IV (lig4)的胚胎，完整的同源重組修復途徑也介導靶基因替換的效率。但在哺乳動物模式系統中，這種技術的一個主要不足在於純合子小鼠中lig4基因敲除在胚胎階段是致命性的。小鼠中NHEJ途徑的其他組分敲除也是類似胚胎致命性的，或者導致嚴重聯合免疫缺陷相關綜合症。但是在單細胞期胚胎階段，如果NHEJ途徑暫時受到抑制，增加的DNA損傷同時也不破壞發育過程，也可通過同源重組介導的雙鏈斷裂實現靶基因替換，比如短暫表達針對NHEJ途徑某種組分的小幹涉RNA(siRNA)可能足夠長時間和強健地限制NHEJ途徑發揮作用，以便同源重組介導的雙鏈斷裂修復整合進所需的基因構造片段。

雖然RNA幹涉技術或培育合適的基因敲除小鼠來研究移除單個基因的影響來實現，但是RNA幹涉並不總是起作用，而培育基因敲除的小鼠需要花費好幾年的時間和大量的精力。病毒(如慢病毒和腺病毒)轉基因技術又往往會在宿主基因組引入不想要的DNA序列。N-乙基-N-亞硝基脲誘變(ENU mutagenesis)和轉座子介導的基因捕獲技術要麼導致隨機性突變，要麼是基因敲除效率過於低下。隨著ZFN技術的出現，人們也越來越多地利用ZFN技術在序列的特定部位精確的切斷、修改或添加基因來創造新型細胞或整個生物體，而不是引入外源DNA，只是稍微改變植物自身DNA的序列，是一種新型的轉基因技術平臺，與傳統的生物技術費時、耗力和不可預測相比，該技術為動植物轉基因提供了一種新的有效的途徑，並可降低產品開發的成本和複雜性。

ZFN能夠對靶基因進行定點斷裂和基因敲除，顯著提高同源重組效率，是一種高效的新型基因打靶技術， 迄今已在黑長尾猴、大鼠、線蟲、小鼠、中國倉鼠、非洲爪蟾卵細胞、斑馬魚、果蠅、海膽、家蠶、擬南芥、菸草、玉米、大豆等模式生物或經濟物種的細胞或胚胎中,  以及包括iPS 細胞在內的人體外培養細胞系中成功地實現了內源基因的定點突變,  其中果蠅、斑馬魚、大鼠等物種還獲得了可以穩定遺傳的突變體,  這為在新的物種中實現基因打靶帶來了希望。

ZFNs曾用於增強非洲爪蟾卵細胞、線蟲、果蠅及斑馬魚細胞的同源重組(Bibikova et al., 2001; Morton et al., 2006; Meng et al, 2008; Doyon et al., 2008)。在果蠅中ZFNs介導的同源重組頻率相當可觀，有時大於1%的子代發生了同源重組介導的基因打靶事件(Beumer et al., 2006)。在斑馬魚中，30%-50%的個體將ZFN誘導的突變傳給了子代，而7%~18%的子代為突變型。通過SOLEXA測序發現，在形態正常的胚胎中，脫靶現象僅出現1%。

在植物上，Lioyd 等(2005)在擬南芥中用ZFN誘導了染色體基因的定點突變，後代的突變率高達 20%。Voytas的研究小組證明ZFNs可以提高植物基因定點整合和置換頻率，他們在實驗中設計了一個缺失了600bp的靶基因GUS:NPTII,將含有該600 bp的同源DNA片段和ZFNs瞬時表達載體共同轉化菸草原生質體，轉化細胞的10%獲得基因定點置換，比不用ZFNs時效率提高了104~105倍。分子檢測表明20%的重組事件是精確的，沒有伴隨鹼基的缺失或插入(Wright et al.,2005)。這一結果表明利用ZFNs定點切割染色體DNA，可以顯著提高同源重組介導的基因定點整合效率，這為基因定點整合和置換提供了一個非常有潛力的工具。而2009年Meng等和Townsend等分別利用ZFN在玉米和菸草開展研究並且在《Nature》雜誌上發表研究成果，其中陶氏益農與Sangamo公司的科學家利用ZFN將一種雜草耐性基因導入玉米基因組的預設位點，破壞玉米中的ZmIPK1，永久性地與雜草耐性基因相連，將兩個需要的性狀堆疊在一起，抑制肌醇六磷酸的合成，抗除劑基因通過正常繁殖遺傳到下一代，獲得了抗除草劑和減少肌醇六磷酸水平的雙重好處；而明尼蘇達大學和麻省總醫院基因組工程研究中心的研究人員利用ZFN改變菸草植物細胞單個基因的序列，獲得了抗除草劑特性的菸草。

在哺乳動物上，2009年Geurts等報導了利用ZFN技術獲得的基因敲除大鼠，這是該技術首次成功地在哺乳動物胚胎中進行基因操作，研究人員設計了三種ZFN，分別以外源基因GFP、內源基因IgM和Rab38為靶點，將編碼ZFN的DNA或mRNA通過原核注射或胞漿內注射的方法導入大鼠胚胎中，從而獲得了敲除特定基因的轉基因大鼠，而且這一基因操作的結果可穩定遺傳。2010年Mashimo等將編碼特定ZFN的mRNA原核注射至大鼠受精卵中，敲除了IL-2受體γ鏈基因，從而獲得了X連鎖重症聯合免疫缺陷（X-SCID）大鼠，為評估藥物治療和基因治療的效果提供了新的動物模型。ZFN技術在其他哺乳動物身上也得到了成功應用 2010年Carbery等採用ZFN技術成功地敲除了小鼠的Mdr1a、Jag1、Notch3三個基因。2011年Whyte等利用ZFN技術在帶有增強型綠色螢光蛋白（eGFP）基因的轉基因豬的成纖維細胞中敲除eGFP基因，得到了不能發出螢光的後代，成功建立了大動物基因敲除模型。

ZNF技術亦具有潛在的臨床應用前景。傳統的基因治療的方式主要有兩種，一種是利用病毒攜帶完整的基因序列送入人體內或者是注入一小段正確的DNA序列來修正錯誤或者使錯誤的基因不表現，然而到目前為止，事實上科學家都無法確認這些方法在實際應用上是有效率及安全的。而藉由同源互換的原理使得細胞自行修正錯誤的DNA序列是發展基因治療上最基本的原則。這一過程通過兩個獨立的步驟完成：首先在DNA中引入一個雙鏈斷裂，啟動細胞自身的修復系統；之後「同源重組」參考引入的相似序列作為模板修復這段基因，從而實現指定部位的鹼基替換。

2005年Urnov等針對一個IL2R基因上的突變而引起X-SCID來設計了四個鋅指結構域串聯的ZFN。SCID會使T細胞失去對抗外界入侵及感染的能力，而科學家們結合注入正確的DNA片段及ZFN的方式在培養皿中處理這些SCID的T細胞。利用該系統介導了人類細胞IL2R酌的高效修復。在無選擇壓力下修復效率達15%~18%，而實際在體內，修正後的細胞比原來的突變細胞具有選擇優勢，故這樣的修復效率已足夠用於基因治療。

2008年Perez等使用鋅指蛋白技術為載體攜帶特異的酶阻斷T細胞中的CCR5基因的表達可促進T細胞清除HIV病毒，研究結果表明，改造的T細胞可有效抵抗HIV。在此幾年前Sangamo生物技術公司就開始設計用於與CCR5基因結合併阻斷CCR5活性的酶，阻斷CCR5活性可激活T細胞抵抗HIV的能力。通常HIV病毒緊緊吸附在CCR5表達的蛋白上，並感染T細胞，我們知道在自然條件下CCR5基因突變的人對HIV具有天然的抵抗力。Sangamo公司開始與位於賓夕法尼亞州費城的Abramson Family 癌症研究所Carl June帶領的實驗室開展合作，設計各種應用酶，從中篩選最適合用於阻斷CCR5基因的酶。他們發現最佳的酶可阻斷人類T細胞中40-60%的CCR5基因的表達活性。

2011年6月Li等通過使用ZFN替換體內的一種功能異常基因hF9，研究人員成功地使患有人血液疾病乙型血友病(hemophilia B)的小鼠恢復了差不多正常的血液凝結功能。這種成就代表著科學家們第一次已經能夠利用ZFN進行的「基因組編輯(genome editing)」來永久地校正活的動物體內的細胞DNA，也為這種技術可能有朝一日用來治療很多人類疾病提供希望。與稱自己為「鋅指公司」的裡奇曼生物技術公司合作，Li等構建了患有人類遺傳缺陷導致的乙型血友病的小鼠---這種疾病是一種遺傳性出血性疾病，特徵在於極其低水平((比正常水平的1%還要少)的凝血因子IX，而這種蛋白是凝血必不可少的。研究人員隨後設計了一種ZFN來切割功能失常的hF9基因的前端，利用一種病毒載體攜帶這種酶到小鼠的製造凝血因子IX的肝臟中。他們將這種ZFN跟一種不同的載體攜帶的正常基因密碼的模板一起注射進兩天大的小鼠的腹部。當小鼠為9周大時，研究小組開始在治療過的一組小鼠和對照組小鼠血漿中測試人凝血因子IX，結果治療過的小鼠中凝血因子水平與正常水平的6-7%一樣高---足夠高使得它們的血液在近乎正常的時間內凝結。

2011年7月Frank Soldner等第一次在人類幹細胞中修飾了單個引起疾病的突變，同時也不用改變幹細胞基因組的任何其他部分。來自懷特海德生物醫學研究所(Whitehead Institute for Biomedical Research)Rudolph Jaenisch實驗室的科學家們利用鋅指核酸酶在誘導性多功能幹細胞α-突觸核蛋白(alpha-synuclein)基因---已知該基因在帕金森疾病(Parkinson's disease, PD)上發揮作用---小心謹慎地插入或移除單個鹼基對。該方法具有對病人起源的人iPSCs(huamn iPSCs, hiPSCs)中引起疾病的點突變進行基因校正的強大能力，代表著基礎生物醫學研究的巨大進步和基於人iPSCs的細胞替代治療方面的一次飛躍。

2011年8月Hoeher等已成功地證明基於ZFN的基因治療技術可以讓導致皮膚起皰的缺陷性蛋白失活。研究人員利用ZFN在體外成功地關閉人皮膚幹細胞中導致皮膚起皰疾病的致病基因，為了更好地證明這種方法可行性，研究人員利用基因工程手段改造皮膚幹細胞，使之攜帶綠色螢光蛋白基因，然後用同樣的特異性ZFN進行處理，結果在每五個處理的細胞當中成功地關閉了其中一個細胞產生的綠色螢光，而且即便在用高劑量ZFN處理後，皮膚幹細胞仍保持著它們再生皮膚的全部潛力。這就為利用ZFN開展基因治療提供希望。

2011年10月Sangamo生物技術公司在Nature雜誌上發表一項臨床前研究論文證實可以利用ZFNs來進行高度特異性和功能性地校正從病人皮膚細胞獲得的iPSCs中α1-抗胰蛋白酶(Alpha 1-Antitrypsin, A1AT)的基因缺陷。研究人員首先使用ZFNs在正確的地方將該基因的基因組剪斷，並用 piggyBac轉座子的將正確版本的基因插入其中，再將該轉座子序列從細胞中剔除，並將人體誘導多能幹細胞能轉化為肝臟細胞，而在修正位點沒有出現任何DNA被破壞的痕跡。隨後，科學家們通過在試管和老鼠實驗中觀察正常α1-抗胰蛋白酶蛋白的活動，證明這種經過修正的基因在他們製造出的肝臟細胞中非常活躍。重要的是，對ZFN校正的iPSCs細胞系進行全編碼序列分析表明ZFN活性帶來的唯一修飾就是對存在缺陷的A1AT基因的修復，從而證明利用ZFNs技術可以實現非凡的特異性，同時還表明基於ZFN的基因組編輯技術的精準性和廣泛適用性使得該技術可以用來治療單基因疾病。

四、ZFN限制
ZNF技術用於臨床治療還有很長的路要走。例如，人們不能預期引入的ZNF蛋白是不是會引起免疫系統的進攻。並且至少到目前為止，這樣的技術似乎只能用於那些可以從病人體內抽取出來的細胞，對他們進行體外操作，再注回病人體內：直接體內注入基因的效率還太低了。最後，ZNF操作在細胞內到底精確程度如何，也必須小心評估：極少的錯誤也可能導致產生細胞癌變等嚴重的後果。

再者，一種DNA靶向技術，若應用於實際的科研或醫療中，需要有高度的特異性，即要避免錯誤的酶切(off-target)。然而事實上，DNA剪切的準確性由於ZNF剪切的機制而並不像人們預期的那樣強：DNA的剪切需要兩個FokI切割區域的二聚化，和至少一個單元結合DNA。因為二聚化的過程是獨立於DNA剪切的，異二聚體的形成，和兩種單元所形成的同源二聚體，同樣可以造成DNA的剪切，並且他們有著不同的識別序列。可以想像，具有較低特異性的同源二聚體形式的ZNF會切割基因組中的假迴文序列。而且，在某些特定條件下，單一ZNF單元結合於DNA(識別序列只有9~12 bp)也會造成DNA的剪切。如此，兩個不同的ZNF單元總共可能產生七種不同識別序列的內切酶。這些非特異性行為均可能帶來ZNF毒性。

2007年Miller等人和Szczeoek等人分別改進了這一技術。他們構建了一系列偏愛異二聚體形成的FokI酶。通過審查FokI的晶體結構，兩個小組均對介導酶的兩個單元結合的兩個alpha螺旋上的胺基酸做了突變，以減少同源二聚體的形成：研究人員構建了一對不對稱的界面。雖然脫靶顯現明顯減少，但是仍然不可避免單個ZNF單元結合於DNA時發生的酶切，也許進一步的發展中，人們需要徹底破壞FokI部分結合DNA的能力。

雖然人們知道ZFN剪切時偶爾會發生脫靶，剪錯位點，導致未曾預料到的裂口，但是直到現在還沒有一種真正綜合性的方法來定義ZFN的特異性，然而人們開始利用ZFNs治療病人和修飾基因組時需要知道這些修飾是在哪些序列位點進行的。
2011年8月發表在Nature雜誌子刊上的兩篇論文描述了兩種系統性地研究這種脫靶作用的方法，從而能夠有朝一日有助於設計出避免間接傷害的基因治療。

在第一篇發表在《自然-方法》Nature Methods雜誌上論文中，為了系統性地描述這些脫靶切割位點，哈佛大學化學生物學者David Liu和他的同事們利用1000億個DNA片段組成的文庫---一些片段在人類基因組中出現---對兩種ZFN進行測試。大多數情況下，這些核酸酶切割靶位點，但是它們偶爾也切割其他類似序列---包括一種與癌症信號傳導途徑相關聯的基因。Liu說，「對我們論文的膚淺理解可能導致一個人對ZFNs持悲觀態度，但是實際上我是樂觀的」。他說，除了證實脫靶裂口所佔份額會隨著較低濃度的ZFNs下降外，研究人員們還發現使用與靶序列結合較差的ZFNs似乎產生更少的意料之外的裂口。這就表明有可能設計出使得這些脫靶效應最小化的ZFN治療。

在第二篇發表在 《自然-生物技術》Nature Biotechnology雜誌上的研究論文中，研究人員們給人白血病細胞施加一種切割CCR-5受體的ZFN。他們首先構建結合到DNA裂口末端的帶有標記的病毒顆粒，然後利用這些病毒顆粒轉染細胞，來鑑定ZFN切割位點，結果他們發現ZFN總體上結合到靶CCR-5 DNA序列。但是，它大約2萬分之一的概率切割序列幾乎相同的另一個受體基因，以及甚至更低概率地切割少數幾個其他的類似序列。但是Sangamo BioSciences公司科技總監同時也是這篇研究論文的共同作者Phillip Gregory說，這些結果都是在研究人員們採用一種極度高濃度的ZFN和極易允許ZFN作用的細胞系的條件下進行的，目的是觀察最糟糕的情形會是什麼樣子。他說，即便是在這些條件下，低概率的脫靶切割事件「證明我們的期望：ZFNs蛋白定會是高度特異性的」，而且暗示在臨床中採用更低藥用劑量將幾乎不可能發生脫靶切割。

這些方法可能有朝一日用於早期藥物開發以便篩選特異性最好的候選藥物。但是人們不清楚這些新ZFN測試的覆蓋面是否剛剛好。比如，採用帶有標記的病毒顆粒的方法可能會遺失一些脫靶切割，因為病毒標記可能並不結合到每個單裂口。再者，不同於試管中的DNA，細胞DNA緊密纏繞成染色質，因而在試管方法中發現的很多結合位點可能在活細胞得到保護並且從不會被ZFNs切割。

總之，ZFNs雖然具有高度特異性和精確性，但是也有打盹的時候，也會在發生極低概率的脫靶事件，在錯誤的DNA序列上發生切割，但是上述兩種系統性地研究這種脫靶作用的方法結果表明在全基因組範圍內，ZFNs錯誤切割另一種序列幾乎相同的基因的概率大約為2萬分之一，以及甚至更低概率地切割少數幾個其他的類似序列。但是這一切都是在研究人員們採用一種極度高濃度的ZFN和極易允許ZFN作用的細胞系的條件下進行的，目的是觀察最糟糕的情形會是什麼樣子。實際情形，發生錯配的概率肯定更低。不過相對於HIV和常常復發的惡性多形性成膠質細胞瘤治療而言，這種極低的脫靶事件還是能夠容忍的。比如，Sangamo生物技術公司開發的用於治療HIV的ZFNs藥物以及用於治療復發性多形性成膠質細胞瘤(recurrent glioblastoma multiforme)的ZFNs藥物也都已經進入臨床I期，另外該公司正在人類安全性試驗中測試一種治療HIV的候選藥物，其中該試驗利用一種ZFN修飾HIV用來侵入細胞的T細胞受體CCR-5。(生物谷：towersimper編著和整理)

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