3D腫瘤顯微鏡可對腫瘤組織進行三維角度分析，簡化腫瘤診斷

2020-11-02 醫師報腫瘤頻道

來源:轉化醫學網



導言：傳統的腫瘤診斷是玻片成像技術，容易耗損病例組織，也不能全方面檢查病理組織，且處理周期長。為了改善這種狀況，維也納工業大學和慕尼黑工業大學一起開發了一項新技術：不僅可以查看腫瘤周圍組織健康程度、切割乾淨程度以及判斷後續是否需要手術或放療。


目前臨床中病理檢查主要使用玻片成像技術（WSI），該技術可以掃描整個玻璃安裝的H＆E染色切片。生成的圖像可以使用專門設計的軟體進行分析。


該檢查的缺點是局部切片，不能完全查看到病理組織的所有情況。由於這種方法的不可逆性，組織已完全用完，因此不再可用於某些分析，例如用於PD-L1的免疫組織化學測試。在PD-L1測試中，未染色的切片不應存放超過2-3個月，否則存在假陰性結果的風險。這意味著患者可能被剝奪了潛在的高效抗腫瘤免疫療法。而且，這項檢查費時費力，因此很難應用於臨床。


近年來，全世界的科學家通過發明新的病理組織成像技術，改善這種狀況。科學家發現了一種新穎的組織清除和光學方法，該方法具有很高的潛力，可以為腫瘤及其微環境提供全面的三維視圖。這項方法價格便宜、快速且易操作，因此可廣泛應用臨床術後病理檢查。


最近，維也納工業大學（維也納）和慕尼黑工業大學一起開發了一項新技術，文章發表在《Scientific reports》上，題為「3D histopathology of human tumours by fast clearing and ultramicroscopy」。這項新技術可以用3D方式去除病理組織，而無需腫瘤切片，顯著提高癌症診斷的可靠性！


圖 文章發表 來源：《科學報告》


拯救生命的組織樣本


維也納工業大學固體電子研究所的 Hans Ulrich Dodt 教授說：「在顯微鏡下，您可以看到切除的腫瘤是否被健康組織所圍繞，如果是這樣的情況，患者只需要等待恢復。如果不是這種情況下，患者需要進行後續手術或放射治療，尤其是乳腺癌經常發生這種情況。」


切片問題在於，永遠不可能完全檢查到整個腫瘤組織。通常，每5毫米組織製作一個約4微米厚的切片。這意味著只檢查帶了整個腫瘤體積的千分之一。而且在關鍵區域，還需要選擇更精細的間距，但是不可能以此方式研究到整個組織。


超顯微鏡的出現


但是，一種超顯微鏡技術可以使整個腫瘤可以以3D模式呈現。Inna Sabdyusheva開發了一種化學方法來「清除」乳腺癌樣品，然後使它們變得透明，但結構保持不變，所以癌細胞仍然可以被識別。


腫瘤3D顯示


然後在超顯微鏡下檢查透明樣品，薄層雷射束即所謂的「光片」穿透組織。然後對樣品進行逐層分析，即使從未切過腫瘤，計算機也可以顯示腫瘤的所有切片。通過這種方式，可以看到被癌細胞堵塞的乳腺導管。


超顯微3D腫瘤顯微鏡操作步驟


為了清除腫瘤，我們提出了一種製備技術，該技術包括三個步驟：

（a）用福馬林/ 5-磺基水楊酸固定和增強組織自發螢光

（b）用2,2-二甲氧基丙烷進行的超快活性化學脫水

（c）在最高56°C下與二苄基醚匹配的折射率

清除後，對腫瘤切除部位成像。圖像經過計算處理後以增強對比度和去除偽影，然後進行3D重建。


用pathoDISCO進行組織處理

（a）實體腫瘤的可逆組織清除和3D成像工作流程

（b）樣品的體積收縮率比較（％），用pathoDISCO和3DISCO清除（n = 16）

（c）從手術到3D重建的組織處理時間表


圖像採集


使用定製的超顯微設置獲取了基於選擇性增強的腫瘤切除部位自發螢光的圖像。我們建立了最佳的自發螢光激發是通過使用488 nm波長的雷射實現的。所發出的螢光通過光學帶通濾光片過濾，截止波長為550±49 nm。


記錄後，對獲取的圖像進行對比度受限的自適應直方圖平衡（CLAHE）46，通過頻域47中的定向空間濾波去除條紋偽影，以及對最終清晰度進行銳化掩蓋。我們發現，按此處理步驟，可以顯著提高對比度。為了通過CLAHE獲得最佳結果，圖像中的灰度級數應儘可能高（例如，對應於65,535灰度級的16位），因為該算法會將不明顯的小亮度差異轉換為人眼可以很好感知的較大差異。


（a）超顯微設置：用於螢光激發的藍寶石雷射器單元（未顯示），分束器立方（BSC），45度銀鏡（M），兩個光片發生器單元（LSG），兩個可移動的線性平臺（LS）沿光束傳播軸（z）的LSG單元，用於將光片的中心疊加在生物樣品的中心；計算機控制的平臺，用於將樣品垂直移動通過光片（VS）；石英容器（QC） ，其中裝有成像介質（DBE）。檢測單元包括配備有用於補償折射率失配的調製器（MO）的×2，×4或×16物鏡，配備有帶通濾光片（BPF）輪的管狀透鏡（TL）和CMOS相機。（b，c）以×2放大率記錄癌症樣品。



由於所有應用的圖像處理步驟都在2D圖像上進行操作，因此它們在計算上不會耗費大量成本，例如3D反卷積方法（需要輸入三維數據）。因此，整個記錄處理鏈基本上可以在記錄過程中使用最新的多處理器計算機實時地執行。


3D重建


預處理後，使用可視化軟體AMIRA 6.7（德國Thermofisher）三維重建了600–2,000張圖像的堆棧。由於腫瘤記錄是單色的，因此必須通過其特徵性自發螢光強度來區分不同類型的組織（圖 1 d1，e1，f1）。我們發現最高的自發螢光強度對應於紅細胞和微鈣化，血管結構和膠原纖維。因此，血管結構和膠原纖維用2×或4×放大倍數（圖變得可見 1 D2，E2），紅細胞（圖 1 F 2，4 G）可以使用16×放大率被識別。核（放大16倍）（圖 4d，f）和脂肪細胞（放大2倍或4倍）（圖2 d，e，3 d）由於自身螢光較低而顯得較暗。


圖1


3D組織病理學應用於人類乳腺腫瘤。突出顯示與癌症相關的組織結構。（a，b）未清除的乳房組織標本。（c）化學組織清除後的同一標本。（d – f）標本的3D重建的代表性圖像。（d1）以×2放大率記錄的DCIS樣品的選擇平面。（d2）具有突出顯示的血管的相同3D重建。（e1）以×16放大率記錄的乳腺癌標本的3D重建選擇平面。（e2）相同的3D重建，突出顯示了血管和有絲分裂活動部位。（f1）以×16放大倍數記錄的乳腺癌樣品的3D重建。（f2）分別觀察同一樣本的血管（參見補充材料中圖4的電影 ）。


02

03

04


為了簡化人類視覺對相關組織結構的檢測和識別，我們開發了幾種顏色圖，可將亮度差異轉換為顏色差異。我們還執行了基於強度的閾值分割，以突出顯示3D重建中與診斷相關的結構。我們可以證明這可以可視化某些癌症標誌。


病理學的革命


Hans-Ulrich Dodt 說：「我們堅信這種方法將徹底改變病理學。在比以前更少的時間內，可以實現更高的檢查可靠性。此外，新的3D方法還為將來的癌症發展提供全新的見解。」


3D腫瘤顯微鏡的使用使病理學工作變得更加容易。Hans-Ulrich Dodt 表示：「病理學家將不再需要在顯微鏡下檢查大量的組織切片，而是可以使用滑鼠在圖像上滾動，這與放射學家現在的工作方式類似。」 Dodt認為，在此過程中生成的大量圖像數據也為人工智慧領域帶來了全新的機會，這樣的電腦程式可以在將來加快並簡化腫瘤診斷。」


參考資料：

【1】https://medicalxpress.com/news/2020-10-cancer-diagnostics-glimpse-tumor-d.html

【2】https://www.nature.com/articles/s41598-020-71737-w



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