ctDNA在腫瘤診斷和治療中的應用

摘要：5月7日，由火石創造發起的一場Link投資人與創業者的巡迴沙龍——精準醫療之腫瘤與液體活檢（北京站）成功舉辦，眾大咖圍繞火石創造大資料庫發布的液體活檢全球地圖（hsmap）進行了深度討論。

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在「液體活檢」沙龍（北京站）中，關於液體活檢的重要分支——ctDNA在腫瘤診斷和治療中的應用，國家癌症中心李文斌帶來了精彩分享。

PPT近40頁，均為嘉賓深度乾貨，若想獲取PPT全部內容，請分享本文，截圖並回復至公眾號。）

李文斌：

從一個大的層面講「腫瘤的精準醫療及液體活檢」，我認為可能會不夠全，所以今天我將從具體的工作實踐以及相關的工作體會中講一些細節，首先我想跟大家說一下精準醫學時代下的腫瘤分子病理檢測。

腫瘤分子病理檢測最主要的作用是分子病理指導下的靶向治療能顯著延長患者的生存期。

1.1 左圖顯示的是乳腺癌的HER2治療，這是最早在臨床上應用的抗腫瘤的一個靶向治療藥物。我們可以看到乳腺癌患者接受了HER2的基因檢測，不管是免疫組化的方法還是FISH的方法，在治療之後他的生存期都可以得到很大程度的延長。

1.2 目前發展最為迅速的肺癌的靶向檢測為EGFR基因突變的檢測。這類檢測所應用的臨床靶向藥物，比如易瑞沙（吉非替尼片）、特羅凱（鹽酸厄洛替尼片）或者我們國產的凱美納（鹽酸埃克替尼片），這三種藥物的應用都能極大地延長EGFR基因突變型（就是敏感突變）患者的生存期。

現在最新的ALK（間變性淋巴瘤激酶），有異位表達的患者大概佔所有肺癌人群的7%到10%，我們的數據是9.7%，這9.7%的病人用ALK抑制劑（克唑替尼或二代的抑制劑）之後，生存期也可以得到很大程度的延長。以往這種ALK陽性患者的生存期很差，因為這類腫瘤往往是實體型腫瘤，惡性程度比較高。

1.3 另外，在結直腸癌的靶向治療領域，愛必妥（西妥昔單抗）的應用也可以極大地延長RS陰性以及BRS陰性患者的生存期。

2. 分子病理檢測可以輔助腫瘤的精準診斷。

比如說，淋巴瘤的基因重排或是EWSR1的FISH檢測能輔助軟組織腫瘤的診斷，也就是說，在傳統的形態基礎上加入分子檢測可以讓腫瘤的診斷更加精確。

3. 分子病理檢測也有助於腫瘤的分子分型。

比如說，乳腺癌不同分子分型的病人對於化療或內分泌治療的響應可能是不一樣的。有些分子分型（比如三陰性乳腺癌）的預後差，對化療或內分泌治療的響應也不太好，但是RA或者RB型的乳腺癌患者預後就非常好。

所以,今天我想在腫瘤分子病理指導精準醫療的基礎上跟大家分享以下幾點：

第一，腫瘤分子病理指導下的腫瘤靶向治療；

第二，液體活檢的概述；

重點分享

液體活檢技術潛在的臨床應用方向；

另外，比較關鍵的一點是如何進行規範化的分子病理檢測及液體活檢。

分子病理指導下的腫瘤靶向治療 

關於靶向治療，我們可以介入到腫瘤治療前、治療中、治療後這三個不同的階段：

第一，治療前的腫瘤組織標本以及細胞學標本，可以進行肺癌的基因突變檢測或FISH檢查，跟組織病理學配合進行靶向篩選。

第二，在治療中，液體活檢真的可以大膽地施手，對血液和體液標本進行療效的動態監測。

第三，治療後。雖然跟普通的化療相比，目前的靶向治療可以延長病人的生存期，但它最大的問題是所有靶向治療的患者都會產生耐藥。

比如肺癌的患者服用易瑞沙（吉非替尼片）、特羅凱（鹽酸厄洛替尼片）一般一年左右的時間就會產生耐藥。所以液體活檢給我們提供了很好的機會。

對於這些耐藥患者，用液體活檢的標準進行基因組學的檢測，看它耐藥的原因，然後針對耐藥的靶點進行治療。但是所有這些對於臨床來講都需要規範化、標準化以及在有室內質控和時間水平的環境下進行的。

這裡給大家簡要介紹一下肺癌靶向治療的相關基因檢測：

剛才提到的EGFR是現在是肺癌治療領域的一個明星分子，EGFR突變可以用乳氨酸免疫抑制劑還有2007年發現的ALK分子在肺癌中和EML4（棘皮動物微管相關類蛋白4）融合，至今不到十年的時間。但是這個藥發展很快，目前已有二代產品，一代是克洛替尼，二代是埃羅替尼。

另外還有MAP基因，MAP基因的基因條例數增加也有相應的靶向治療藥物。而最新FDA批准的是針對Ros1的一個靶向藥物——克唑替尼，但是Ros1的定位很少。

KRAS在肺癌裡的突變率大概是5%到7%，但是KRAS突變不能夠用EGFR的TPR進行治療的，而且KRAS突變的這些靶向藥物目前主要還處於研究中，很少應用於臨床。

除了肺癌之外，還有一個跟基因檢測密切相關的癌，就是結直腸癌，但是目前指南批准的主要是用於轉移性的結直腸癌，也就是四期的結直腸癌。對於早期的結直腸癌我們不推薦用靶向藥物治療。

結直腸癌檢測的基因主要是Ras基因，Ras基因是一個家族，它包含了各種Ras基因，最開始主要是進行KRAS的檢測，但是在去年，不管是美國的指南還是歐洲、日本的指南都推薦進行全Ras基因的檢測。

現在我們所能做的除了Ras基因之外還有非Ras基因的檢測，目前有一些臨床實驗表明非Ras基因突變對於腸癌的靶向治療也是一個耐藥分子，但是還沒寫在指南裡。

分子病理實驗室基因突變檢測一般的操作流程是這樣的：

目前基於組織標本的檢測，比如手術標本或穿刺活檢的組織，病理科會對腫瘤標本自備，我們有一個完整的標準自備流程，因為標準自備會影響到後期基因檢測的結果，因此，

第一步的腫瘤標本自備和病理學形態評估非常重要；

第二是DNA的提取和質量控制，有些標本可能製得很好，但是DNA提取過程不行，也做不出來；

第三是進行基因突變的檢測，RaX檢測是現在臨床上最常規和簡便易行的方法；

第四是結果分析和檢測報告：所有這些都需要質量控制。

基於外周血的基因突變檢測，現在常規做的是組織病理檢測和胸腹水，當然胸腹水得經過細胞血，就是具有發細胞病例資質的醫生確認胸腹水裡面有腫瘤細胞才可以進行檢測。

但對於這種手術切除的冰凍組織我們一般不推薦，因為一般只有等到福馬林固定標本之後才可明確地區分它是腺癌還是鱗癌，而這個分型對於肺癌非常有意義。肺癌的突變和這些靶向藥物主要用於腺癌病人，鱗癌病人目前沒有特別好的靶向藥物。

我們現在認為外周血的突變檢測是一個很好的發展方向，但是可能還需要做一些工作才能夠真正在臨床上推廣應用。

液體活檢的概述

關於液體活檢的概述，之前腫瘤學專家已經講了很多。

大家推測血漿中游離DNA來源於腫瘤組織壞死、凋亡及分泌，ctDNA的長度是大約170個BP，它含有腫瘤特定的基因突變。

這是在不同類型的腫瘤ctDNA檢測中的應用，不光是用於基因突變，它還可以甲基化，做拷貝數變異：

ctDNA檢測的特異性為100%，而敏感性從50%到75%不等，所以我們得用更精確的方法去做ctDNA的檢測。

通常一代測序的敏感性為10%左右，也就是說一百個腫瘤細胞裡面小於十個細胞有突變是檢測不到的。

另一個是二代測序，去年剛在廣州發布了二代測序的指南，但是二代測序現在在臨床上大規模應用還處於實驗階段，沒有真正用到臨床檢測上。

然後就是定量PCR，之後就是RM方法，RM方法現在是臨床使用規模最大的一種基因突變檢測的方法。為了達到液體活檢的準確性，我們可能需要更精確的測序方法。

但是，因為靈敏性提高的時候，特異性可能會下降，反之亦然。所以我們需要在特異性和靈敏性的選擇上進行平衡。當然，這種平衡在不同的腫瘤、不同腫瘤的不同亞群以及在不同的檢測時間和檢測方式上都會不同。

液體活檢技術潛在的臨床應用方向

下面再跟大家簡要介紹一下液體活檢潛在的臨床的應用方向。

一、液體活檢-克服腫瘤異質性問題 

二、液體活檢-靶向治療耐藥監測 

三、液體活檢-檢測腫瘤治療效果 

四、液體活檢-腫瘤早期診斷 

第一個應用方向：液體活檢可以克服腫瘤的異質性問題。

腫瘤的異質性是在基因檢測和治療過程中面對的一個最大的難題，主要分為幾個方面：

第一，每個不同個體之間的腫瘤有異質性。

第二，同一塊腫瘤的瘤體內的癌細胞之間也有異質性；比如乳腺癌，一塊是一種病理類型，一塊又是另一種類型，這也就是瘤體內癌細胞的異質性，這種抑制性在肺癌、乳腺癌、結直腸癌裡面都很常見。第三，原發灶和轉移灶之間的抑制性；比如從原發的肺轉移到腦部或者淋巴結時，在基因層面上，繼發灶和原發灶腫瘤之間往往存在異質性。第四，不同的轉移灶之間的異質性；比如說結直腸癌的肝轉移，肝上可以形成很多的病灶，每個轉移灶之間也有異質性。

異質性從哪來？

一是原發灶早期中的亞克隆，不同的克隆會產生不同的基因突變的類型；

二是，所有的治療都是一種外界壓力，從進化角度來說，當你對靶向治療或化療給予進化壓力的時候，耐藥性最強的癌細胞往往都存活下來了，而耐藥性不強的細胞都死了。耐藥性很強的細胞存活下來了就會產生不同的基因突變。

因而，ctDNA究竟能不能夠反應組織學上的腫瘤異質性問題也是很多人想研究的地方。

我在一個專業的醫學搜索期刊文獻的網站上沒有找到關於ctDNA對於肺癌或者結直腸癌的異質性的報導，但找到一篇關於乳腺癌的，這篇文章的結論是：ctDNA能準確反應轉移性乳腺癌原發灶和轉移灶基因突變的變化，也就是說ctDNA可以反應乳腺癌的腫瘤異質性。

第二個可能的潛在應用方向是：液體活檢的靶向治療和耐藥監測。

靶向治療所有的病人都會耐藥，耐藥之後的治療怎麼辦，什麼時候耐藥，這是非常值得關心和研究的一個點。一是因為融合基因的地方有基因免疫的突變，基因免疫突變後病人對之前的藥物不再受用。

另外，比如說肺癌的EGFR的TGM突變佔到耐藥機制的50%，但也不是全部。它的耐藥機制還包括比如說基因的擴增、CNA拷貝數的變化，我們只能用液體活檢加二代測序這種測得更深更廣的方法來實現耐藥監測。

另外，對於沒有突變的病人用藥，一段時間之後也可能產生新的基因突變。

所以說靶向治療的耐藥監測是液體活檢可能是很好的應用方向。

液體活檢還有一個重要的應用方向：檢測腫瘤殘存病灶和治療效果。

腫瘤標誌物的檢測也叫血液檢測，但血液檢測和腫瘤標誌物檢測哪個更優呢？這篇文章中告訴我們，CTDNA可能優於現在的蛋白檢測，因為DNA的變化更靈敏和更精確。

另外還需要注意的問題是，適用範圍是四期結直腸癌，直腸癌肝轉移的患者可以通過ctDNA可以有一個很好的療效監測。

對於二期的結腸癌的患者，CTDNA的方法可能永遠看到這個病人活得很好的，為什麼？因為二期的結直腸癌患者生存率很好，而且術後很多患者不需要經過其他任何治療，手術做完就沒事了。

另外，液體活檢可以監測腫瘤的動態變化及預測復發，這是一個腫瘤的負荷，我們可以看到曲線圖，腫瘤的變化跟ctDNA的變化能夠很好的符合。

液體活檢能不能用於腫瘤的早期診斷？

如何進行規範化的分子病理檢測及液體活檢

最後跟大家簡要的說一下規範化的分子病理檢測及液體活檢。所有的分子病理檢測以及診斷的目的是跟臨床療效直接相關的，臨床療效是評價分子病理檢測平臺和技術的金標準。

這是國外2016版ECC指南推薦的肺癌的基因檢測，它推薦的是必須在FDA批准的實驗室進行分子檢測，這涉及到標準和規範的問題。

我國我以肺癌為例，肺癌的EGFR突變檢測的專家共識在2011年已經發表了，在去年也發表了肺癌的血液基因突變。

總結一下，這也是我從共識裡面摘抄的話：

最後想跟大家說的是，任何的分子病理檢測，檢測的標準與規範一定是放在首位的，技術可能都是用了很多年的技術才能方便易行、標準規範，真正的應用到臨床檢測中。

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